PCR-DGGE技術分析腌制麻竹筍中微生物多樣性

鄭 炯，夏雪娟，葉秀娟，林 茂，闞建全,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

PCR-DGGE技術分析腌制麻竹筍中微生物多樣性

鄭 炯1,2，夏雪娟1，葉秀娟1，林 茂1，闞建全1,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術對鹽質量濃度5 g/100 mL和19 g/100 mL腌制麻竹筍的微生物區系進行研究。結果表明，經DNA提取、巢式PCR、DGGE電泳和克隆測序后，從低鹽質量濃度（5 g/100 mL）腌制筍中分離出4 條明顯的亮帶，經鑒定分別為食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、乳球菌屬（Lactococcus sp.）、魏斯氏菌屬（Weissella sp.）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）；從高鹽質量濃度（19 g/100 mL）腌制筍中分離出5 條明顯的亮帶，經鑒定分別為綠色氣球菌（Aerococcus viridans）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus sp.）、未得到培養的細菌（uncultured bacterium）、厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus sp.）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）；低鹽腌制筍的優勢菌多為益生菌，而高鹽腌制筍的優勢菌則多為抗性較強的菌。基于16S rDNA的PCR-DGGE技術為分析腌制麻竹筍中微生物多樣性提供了一條可靠、快速的有效途徑。

腌制麻竹筍；16S rDNA；聚合酶鏈式反應；變性梯度凝膠電泳；多樣性

竹筍歷來深受人們喜愛，不但味美可口，還富含人體所需要的營養物質，包括糖類、蛋白質、膳食纖維、多種礦質元素和維生素等，是一種具有極高營養價值的天然食品[1]。大葉麻竹筍（Dendrocalamus latiflorus）是叢生竹筍的一種，具有適應性廣，產量高等特點。近幾年來，我國南方地區開始大量種植麻竹筍，但是由于鮮筍的采收季節性和貯藏過程中易木質化等因素的影響，嚴重制約了鮮麻竹筍的生產和消費。所以，必須對麻竹筍采后進行加工。腌制是麻竹筍的一種常用加工方式[2]，其加工簡易、成本低廉、易于保存，腌制麻竹筍具有獨特的色、香、味，為其他加工品所不能代替。

蔬菜通過腌制發酵將形成多種風味化合物，使其具有特殊的風味和營養價值。腌制蔬菜的風味形成過程中，除了蔬菜本身的風味外，其他的風味形成途徑均與微生物的發酵作用有關，所以分離和鑒定腌制蔬菜中的微生物區系對于揭示腌制蔬菜的風味形成具有重要作用。近年來，國內外也有許多學者對腌制蔬菜中的微生物多樣性進行了研究[3-5]。目前，巢式聚合酶鏈式反應（nested-polymerase chain reaction，nested-PCR）配合變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術是被認為是研究微生物系統發育的有力手段，近幾年來，在泡菜[6]、榨菜[7]、韓國泡菜[8]等腌制蔬菜的微生物生態研究上應用廣泛，但對腌制麻竹筍中的微生物群落結構尚缺乏研究。因此，本研究擬采用PCRDGGE技術分析傳統腌制麻竹筍中的微生物多樣性，進一步揭示腌制麻竹筍中的主要優勢菌群并比較不同鹽濃度之間的差異，為腌制麻竹筍的質量控制和風味成分的形成機理研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腌制麻竹筍 大葉麻竹筍原料采于重慶市北碚區施家梁鎮大葉麻竹筍種植基地，將麻竹筍洗凈、切分、漂燙、瀝干、冷卻后，按傳統加工方法加鹽（低鹽5 g/100 mL、高鹽19 g/100 mL）在室溫下進行腌制，60 d左右基本成熟。

Tris、TEMED、尿素、過硫酸銨、40 g/100 mL丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺（37.5∶1，m/m）溶液、DNA Marker F（GM339） 生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖、溶菌酶、通用細菌基因組DNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒、GeneGreen核酸染料（RT210）北京天根生物技術有限公司；pEASYTM-T5 Zero Cloning Kit（CT501） 北京全式金生物技術有限公司；TaKaRa Taq（5 U/μL）、10×PCR buffer（Mg2+free）、dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）、MgCl2（2.5 mmol/L）寶生物工程（大連）有限公司。所有引物合成及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 儀器與設備

SIM-F140AY65制冰機 日本三洋電器集團；DF8517超低溫冰箱 韓國Ilshin公司；梯度PCR儀、VerSa Doc凝膠成像系統、DCodeTMSystem變性梯度凝膠電泳系統 美國Bio-Rad公司；NanoDrop 2000微量紫外分光光度計 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

用無菌槍頭吸取3 mL竹筍腌制發酵液，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA。為提高DNA濃度和得率，最后用80 μL緩沖液溶出DNA，并將得到的溶液再加入吸附柱中，室溫放置2 min后，12 000 r/min離心2 min。提取得到的基因組DNA用紫外分光光度計測出濃度后-20 ℃保存，作為后續PCR的模板。

1.3.2 巢式PCR

1.3.2.1 16S rDNA的PCR反應

以提取的細菌基因組DNA為模板，用16S rDNA通用正向引物27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和反向引物1492r（5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’）進行擴增，擴增產物長度約為1 500 bp[9]。擴增體系為：DNA模板50 ng，正向和反向引物各0.1 μL（10 μmol/L），10×buffer（Mg2+free）2.5 μL，Mg2+2.5 μL，dNTP 1 μL，Taq酶0.2 μL，滅菌的超純水補足至25 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，55.5 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環，72 ℃延伸7 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，作為巢式PCR的模板。

1.3.2.2 16S rDNA V3區的PCR反應

以16S rDNA擴增產物為模板，使用357f和518r對16S rDNA的V3可變區進行擴增[10]。并在上游引物357f（5’- CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）的5’末端加上40 bp的GC夾子（CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G），下游引物為534r（5’- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’），擴增產物長度約為200 bp。

50 μL反應體系：模板50 ng，正向和反向引物各0.2 μL（10 μmol/L），10×buffer（Mg2+free）5 μL，Mg2+5 μL，dNTP 3 μL，Taq酶0.4 μL，滅菌的超純水補足至50 μL。采用降落PCR反應程序：94 ℃ 5 min，94 ℃40 s，65～55 ℃ 1 min （每個循環降低0.5 ℃），72 ℃30 s，20 個循環，94 ℃ 40 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，29 個循環，72 ℃延伸7 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于-20 ℃冰箱保存備用，作為后續DGGE分析的樣品。

1.3.3 DGGE分析

采用美國Bio-Rad公司的DcodeTM通用突變檢測系統對純化的巢式PCR擴增產物進行電泳分離分析。分別取不同樣品的巢式PCR擴增產物15 μL與3 μL 6×Loading Buffer混合后加入到點樣孔中，采用8%丙烯酰胺變性凝膠，變性劑質量濃度梯度范圍為30～60 g/100 mL，在1×TAE緩沖液中，恒溫60 ℃、恒壓150 V條件下電泳210 min。電泳結束后取出膠放入200 mL Gene Green染液中搖蕩浸染20～30 min，使用紫外凝膠成像系統拍照[11]。

1.3.4 DGGE片段的回收、擴增

用無菌手術刀切下所需的共有主條帶和差異性特征條帶，分別放入已滅菌的1.5 mL離心管中，用槍頭搗碎凝膠，加入20 μL滅菌超純水4 ℃過夜[12]，之后取2 μL溶出液，以不帶GC夾子的細菌巢式PCR引物對回收DNA片段進行擴增，反應體系及程序與細菌巢式PCR一致。目標片段約為200 bp，擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于-20 ℃冰箱保存備用，作為后續克隆的目的片段。

1.3.5 克隆與測序

采用北京全式金生物技術有限公司零背景、無需藍白斑篩選的pEASYTM-T5 Zero Cloning Kit對擴增片段進行克隆。因不同體系的反應程序不同，本研究的步驟為：在1.5 mL滅菌離心管中加入模板DNA 50 ng，加入1 μL載體，無菌超純水定容至5 μL。室溫反應8 min，向離心管中加入50 μL剛解凍的感受態細胞，輕彈混勻，冰浴30 min。42 ℃熱激30 s，立即置于冰上。加入已平衡至室溫的250 μL不含氨芐的LB液體培養基，200 r/min、37 ℃培養1 h使細胞復蘇。取200 μL菌液均勻涂布于含有80 μg/mL氨芐抗生素的LB固體培養基上，37 ℃培養過夜。分別挑取3 個單菌落至1.5 mL LB液體培養基 （含有80 μg/mL氨芐抗生素） 中，37 ℃、150 r/min培養8 h后用質粒小提試劑盒提取質粒。

以提取質粒DNA為模板，用試劑盒中的M13F和M13R引物進行擴增，擴增體系為：DNA模板50 ng，正向和反向引物各0.5 μL（10 μmol/L），10×Buffer （Mg2+free） 2.5 μL，Mg2+2.5 μL，dNTP 4 μL，Taq酶0.5 μL，滅菌的超純水補足至50 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，55.5 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環，72 ℃延伸7 min。目的片段 約350 bp，擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果去掉質粒序列后登陸GenBank數據庫，進行BLAST比對后，使用MEGA 5軟件包采用鄰接（Neighbor-Joining）法繪制系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 細菌基因組16S rDNA擴增結果

低鹽（5 g/100 mL）和高鹽（19 g/100 mL）質量濃度腌制麻竹筍的細菌基因組DNA經特異性擴增后得到的16S rDNA片段。由圖1可知，各泳道均在1 500 bp左右有亮帶，說明目標片段被成功擴增。

圖1 16S rDNA片段擴增圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products

2.2 巢式PCR擴增結果

巢式PCR可減少非特異性擴增，提高目的片段的濃度和純度。由圖2可知，腌制發酵液的16S rDNA V3區均被成功擴增，且條帶清晰，無雜帶、無拖尾，可用于DGGE凝膠電泳。

圖2 16S rDNA V3區擴增圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of 16S rDNA V3 region

2.3 DGGE電泳結果

圖3 16S rDNA V3區PCR-DGGE指紋圖譜Fig.3 PCR-DGGE analysis of 16S rDNA V3 region

2 種腌制筍的16S rDNA V3區片段DGGE結果如圖3所示，低鹽腌制筍共得到4 條較亮的帶，分別編號為L-1、L-2、L-3、L-4，高鹽腌制筍主要有5 條亮帶，分別編號為H-1、H-2、H-3、H-4、H-5，對編碼條帶進行切膠回收，以進一步鑒定各條帶代表的菌的種類。

2.4 DGGE回收片段的擴增結果

圖4 DGGE回收片段的擴增Fig.4 Agarose gel electrophoresis of fragments recovered from DGGE bands

由圖4可知，經切膠回收后得到的9 條片段擴增后均在200 bp左右有清晰條帶，說明9 條片段均被成功擴增，且擴增產物無拖尾現象，可直接用于克隆。

2.5 克隆結果

圖5 DGGE回收片段克隆后的擴增Fig.5 Agarose gel electrophoresis of clones of amplified fragments recovered from DGGE bands

DGGE條帶克隆結果如圖5所示，各泳道在350 bp左右均有清晰亮帶，說明各條帶均被成功克隆，可直接送出測序。

2.6 測序結果

各條帶測序結果經BLAST比對后結果見表1，將序列與GenBank中的近似序列進行比對，并構建進化樹，見圖6。

表1 DGGE圖譜條帶序列比對結果Table1 Closest match identification of DGGE bands

圖6 DGGE條帶序列與GenBank數據庫中相關序列的相似性分析Fig.6 Similarity analysis of sequences derived from DGGE bands and related sequences from GenBank

如果兩個分類單位間的16S rDNA序列同源性＞97%，則認為能達到鑒定的目的。由表1和圖6可以看出，各比對結果的同源性均大于97%，說明均具有鑒定意義。

由表1和圖6可知，L-1和L-3同屬于魏斯氏菌屬（Weissella sp.），L-2和L-4同屬于乳球菌屬（Lactococcus sp.）；H-1為綠色氣球菌（Aerococcus viridans），H-2屬于賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus sp.），H-3為未得到培養的細菌（uncultured ba cterium），H-4屬于厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus sp.），H-5屬于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

3 結論與討論

本實驗采用PCR-DGGE技術對低鹽質量濃度和高鹽質量濃度腌制麻竹筍的微生物區系進行研究，經巢式PCR、DGGE電泳、克隆測序后，從低鹽腌制筍中分離出4 條明顯的亮帶，經鑒定分別為食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、乳球菌屬（Lactococcus sp.）、魏斯氏菌屬（Weissella sp.）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），分屬于乳球菌屬（Lactococcus sp.）和魏斯氏菌屬（Weissella sp.）。從高鹽腌制筍中分離出5 條明顯的亮帶，經鑒定分別為綠色氣球菌（Aerococcus viridans）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus sp.）、未得到培養的細菌（uncultured bacterium）、厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus sp.）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

由鑒定結果可以看出，鹽質量濃度較低時，腌制筍中的優勢微生物主要為乳球菌屬和魏斯氏菌屬。乳球菌屬是傳統發酵泡菜中的主要微生物[4]，對泡菜風味品質的形成具有重要作用。而魏斯氏菌是發現較晚的乳酸細菌，1993年Collins等[13]提出了魏斯氏菌屬（Weissella sp.）的名稱，可產酸、產細菌素，多存在于發酵食品中[14]。如Han等[15]在辣白菜中發現了魏斯氏菌，并指出它是一種新的乳酸細菌。商婷婷等[16]指出，泡菜水是魏斯氏菌的優良生活環境。Ayeni等[17]指出魏斯氏菌可作為益生菌進行開發利用，但其安全性需進一步驗證。

相比較低鹽質量濃度的腌制筍，高鹽腌制筍中的優勢菌群發生明顯變化，菌群種類趨向于耐鹽菌，如氣球菌和芽孢桿菌。綠色氣球菌為氣球菌屬的模式種，10%的NaCl不妨礙其生長[18]，多存在于水產品中。目前有關綠色氣球菌的研究多集中于其致病性的研究[19]，也有部分學者從食品中分離鑒定出了綠色氣球菌，如黃鍵等[20]從瓶裝泥螺和蟹糊中分離鑒定出了綠色氣球菌，并指出其具有膠原蛋白酶和酪蛋白酶活性。任廣鳴[21]從魚露中分離出綠色氣球菌，并指出其是魚露中的主要耐鹽產酸菌。賴氨酸芽孢桿菌屬主要包括紡錘芽孢桿菌（Bacillus fusiformis）、球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）和耐硼賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus boronitolerans）[22]。大多數賴氨酸芽孢桿菌來自于環境中，如土壤、潮灘沉積物等。在食品中，目前僅有Kim[22]和Nam[23]等從發酵豆制品中分離出了賴氨酸芽孢桿菌。厭氧芽孢桿菌屬屬于芽孢桿菌科，包括嗜熱厭氧芽孢桿菌（Anoxybacillus pushchinoensis）和好熱黃無氧芽孢菌（Anoxybacillus fl avithermus）2 個種，可致竹筍罐頭腐敗[24-25]。芽孢桿菌屬也屬于芽孢桿菌科，廣泛存在于食品中。

綜上所述，基于16S rDNA的PCR-DGGE技術為研究腌制麻竹筍中的微生物區系組成提供了一條可靠、快速的有效途徑。比較不同鹽質量濃度腌制筍的微生物群落結構，結果表明低鹽質量濃度和高鹽質量濃度腌制麻竹筍的微生物區系具有明顯差別，低鹽腌制筍的優勢菌多為益生菌，而高鹽腌制筍的優勢菌多為抗性較強的菌，包括腐敗菌和益生菌。這些微生物區系的分離和鑒定，對于進一步研究腌制麻竹筍的風味形成機理和腌制工藝的改進具有重要的作用。本實驗只是對不同鹽質量濃度腌制麻竹筍成品的微生物區系進行了初步的鑒定和分析，但對麻竹筍腌制過程中各時期的微生物群落變化還需要進一步的研究，以期為下一步腌制麻竹筍的風味形成機理和腌制工藝的改進奠定基礎。

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Diversity of Microbial Flora from Pickled Ma Bamboo Shoots Analyzed by PCR-DGGE

ZHENG Jiong1,2, XIA Xue-juan1, YE Xiu-juan1, LIN Mao1, KAN Jian-quan1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

The microbial fl ora in pickled Ma bamboo shoots with low (5 g/100 mL) and high salt concentration (19 g/100 mL) was studied by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE). The results showed that after DNA extraction, nested PCR, DGGE, cloning and DNA sequencing, 4 clear bands were separated from the low-salt pickled bamboo shoots, and identif i ed to be Weissella cibaria, Lactococcus sp., Weissella sp. and Lactococcus lactis, respectively. Five clear and bright bands were separated and identif i ed from the high-salt pickled bamboo shoots, including Aerococcus viridans, Lysinibacillus sp., uncultured bacterium, Anoxybacillus sp. and Bacillus sp.. The dominant bacteria in the low-salt pickled bamboo shoots were mostly probiotic bacteria, while bacteria with higher resistance were mostly found in the highsalte bamboo shoots. In conclusion, PCR-DGGE based on the 16S rDNA can provide a reliable, fast and effective way for the analysis of microbial diversity in pickled Ma bamboo shoots.

pickled Ma bamboo shoots; 16S rDNA; polymerase chain reaction (PCR); denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); diversity

TS201.3

A

1002-6630（2014）21-0170-05

10.7506/spkx1002-6630-201421033

2013-11-29

中央高校基本科研業務費專項資金項目（XDJK2013C131）

鄭炯（1982—），男，博士，講師，研究方向為食品化學、果蔬加工。E-mail：zhengjiong_swu@126.com

*通信作者：闞建全（1965—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與營養學、食品生物技術。E-mail：ganjq1965@163.com