多穗柯三葉苷對脂多糖誘導小鼠炎癥反應的保護作用

范小龍，董華強，張英慧,*，劉 欣,*

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.佛山科學技術學院食品與園藝 學院，廣東 佛山 528231）

多穗柯三葉苷對脂多糖誘導小鼠炎癥反應的保護作用

范小龍1，董華強2，張英慧2,*，劉 欣1,*

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.佛山科學技術學院食品與園藝 學院，廣東 佛山 528231）

探討多穗柯三葉苷對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠炎癥反應的抗炎癥作用。以3、30、300 mg/（kg·d）3 個劑量組的多穗柯三葉苷灌胃小鼠3 d后，腹腔注射0.1 mg/kg LPS，觀察三葉苷預處理對LPS誘導的炎癥因子表達的影響。酶聯免疫反應測定小鼠血清中 炎癥因子腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的含量，實時定量聚合酶鏈式反應法檢測肝組織中TNF-α和IL-6的mRNA水平，免疫組織化學染色檢測小鼠肝組織中TNF-α和IL-6蛋白水平。結果表明，3 mg/（kg·d）三葉苷劑量組可顯著抑制LPS誘導的小鼠血清中TNF-α和IL-6的分泌，降低肝組織中TNF-α和IL-6的表達水平。多穗柯三葉苷對小鼠的炎癥反應具有一定的保護作用。

多穗柯；三葉苷；抗炎作用；脂多糖；炎癥反應

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組成成分，同時也是這些細菌引發炎癥反應的主要物質[1]。LPS通過其與哺乳動物細胞表面的Toll樣受體（TLR）4/CD14復合體的結合[2]，激活細胞信號 通路從而引發炎癥因子的過量表達，包括腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）[3-5]。細胞炎癥因子的過量分泌會引起全身炎癥反應綜合征、組織損傷、代謝綜合征等疾病，甚至導致死亡。降低TNF-α、IL-6等因子的表達是預防機體炎癥反應的重要措施。

多穗柯（Lithocarpus polystachyus Rehd）為殼斗科柯屬植物，主要分布于我國長江以南各省區，其嫩葉中富含植物化學活性成分[6-8]。本課題組從多穗柯的嫩葉中分離出一種甜度較高的二氫查耳酮——三葉苷（根皮素-4’-β-D-葡萄糖苷，結構如圖1所示），前期研究表明三葉苷對糖尿病關鍵酶（α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶）活性有明顯的抑制作用[9]。相關研究證實三葉苷具有較強的抗氧化活性[10-11]。目前尚未見對其潛在抗炎癥作用的研究。本實驗 旨在研究多穗柯三葉苷對LPS誘導的小鼠炎癥因子表達的影響。

圖1 三葉苷的化學結構Fig.1 Chemical structure of trilobatin

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級BALB/c雌鼠，6～8 周齡，體質量18～22 g，許可證號：SCXK（粵）2008-0002，由廣東省醫學實驗動物中心提供。

三葉苷（純度＞99%），分離純化自多穗柯嫩葉[9]。

LPS（E.coli O26:B6） 美國Sigma公司；小鼠TNF-α酶聯免疫吸附反應（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒、小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒 上海依科賽生物制品有限公司；RNAiso Plus試劑 日本TaKaRa公司；M-MLV First Strand Kit 美國Invitrogen公司；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 日本Toyobo公司；熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物 上海英濰捷基公司；TNF-α抗體、IL-6抗體 美國Santa Cruz公司；免疫組化染色試劑盒 武漢博士德公司。

1.2 儀器與設備

核酸蛋白檢測儀、高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；SpectraMax M2型多功能酶標儀 美國MDC公司；Stat-Fax 2600型自動洗板機 美國Awareness公司；梯度PCR儀 德國Biometra公司；7500型熒光定量PCR儀 美國Applied Biosyst ems公司；光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的建立

采用小劑量LPS注射的方法建立炎癥反應小鼠模型[12]。LPS模型對照組和三葉苷各劑量組小鼠腹腔注射（按體質量計，下同）0. 1 mg/kg LPS[13]，空白對照組注射等體積的生理鹽水。腹腔注射后0、2、4、8 h，摘除眼球采血，分離血清，測定血清中TNF-α和IL-6的含量。

1.3.2 實驗動物分組與處理

60 只BALB/c雌鼠隨 機分為5 組，每組12 只，分別為空白對照組，LPS模型對照組，三葉苷低、中、高劑量組分別以3、30、300 mg/（kg·d）的劑量灌胃小鼠，連續灌胃3 d；空白對照組及LPS模型對照組灌胃等體積溶媒（0.5%羧甲基纖維素鈉）。于末次灌胃1 h后，三葉苷各劑量組和LPS模型對照組腹腔注射0.1 mg/kg LPS，空白對照組注射等體積的生理鹽水。腹腔注射2 h后，摘除眼球采血，分離血清，-20 ℃保存待測。取血后立即開腹取肝組織：一部分肝組織立即用4%的多聚甲醛溶液固定，進行免疫組化分析；剩余肝組織-80 ℃保存待測mRNA的表達變化。

1.3.3 ELISA檢測

收集各組小鼠血清，按ELISA試劑盒說明書操作，對血清中TNF-α和IL-6進行測定。在450 nm波長處測定OD值，根據標準曲線計算TNF-α和IL-6的分泌量。

1.3.4 熒光定量PCR檢測

按RNAiso Plus試劑方法提取肝組織中的總RNA，用一定量DEPC水溶解RNA，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完 整性，利用核酸蛋白檢測儀測RNA溶液的濃度和純度。TNF-α和IL-6及內參基因β-actin的mRNA擴增采用兩步法進行：首先利用逆轉錄酶M-MLV和隨機引物完成RNA的逆轉錄反應；合成的cDNA用無菌水稀釋為4 ng/μL，按表1提供的引物序列進行熒光定量PCR反應。反應采取20 μL體系，即SYBR Green Mix 10 uL，上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），cDNA 2 μL，三蒸水7 μL。反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 1 min； 95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40 個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。用2-ΔΔCt法分析TNF-α和IL-6 mRNA的相對含量。

表1 熒光定量PCR引物TTaabbllee 11 PPrriimmeerrss uusseedd ffoorr rreeaall--ttiimmee qquuaannttiittaattiivvee PPCCRR

1.3.5 免疫組化檢測

小鼠肝組織在多聚甲醛固定24 h，脫水后常規石蠟包埋切片，切片約4 μm厚，貼于預先涂有鉻釩明膠的載玻片上。采用免疫組化染色SABC（strept avidin-biotincomplex）法檢測在小鼠肝組織中TNF-α和IL-6的表達，蘇木素細胞核復染，顯微鏡下取400×視野下觀察標本，照相。TNF-α和IL-6陽性染色結果為胞內區域被部分或均勻地染上棕 紅色。

1.4 統計學分析

2 結果與分析

2.1 LPS誘導小鼠炎癥反應模型的建立

圖2 LPS誘導小鼠炎癥反應模型的建立Fig.2 Establishment of animal model of LPS-induced inflammatory response

本實驗以0.1 mg/kg的劑量腹腔注射LPS建立小鼠炎癥反應模型。如圖2所示，空白對照組小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量在0、2、4、8 h始終保持極低水平；與空白對照組相比，LPS模型對照組小鼠腹腔注射LPS 2 h后，血清中炎癥因子TNF-α和IL-6的含量顯著升高（P＜0.05），分別達到（243.63±43.07）pg/mL和（1 435.71±232.17）pg/mL，隨后其含量下降，到8 h時恢復到正常水平。

2.2 三葉苷降低LPS誘導的小鼠血清TNF-α和IL-6含量

表2 三葉苷對小鼠血清中TNNFF--α和IL-6分泌的影響Table2 Effect of trilobatin on the secretion of TNF-α and IL-6 in mouse serruumm

小鼠血清中的TNF-α和IL-6含量用ELISA法檢測。由表2可知，與正常對照組相比，LPS模型對照組小鼠血清中TNF-α和IL-6含量顯著升高（P＜0.05）。與LPS模型對照組相比，三葉苷低劑量組可顯著降低血清TNF-α和IL-6含量（P＜0.05），其中TNF- α為LPS模型對照組的40.45%，IL-6為LPS模型對照組的48.34%；三葉苷中劑量組可降低血清TNF-α的含量，但其IL-6含量與LPS模型對照組無顯著性差異；三葉苷高劑量組血清中TNF-α和IL-6含量均與LPS模型對照組無顯著性差異。

2.3 三葉苷抑制LPS誘導的小鼠肝組織TNF-α和IL-6 mRNA表達

表3 三葉苷對小鼠肝組織中TNNFF--α和IL-6 mRNA表達的影響Table3 Effect of trilobatin on TNF-α and IL-6 mRNA expression in mouse livveerr

由表3可知，與空白對照組相比，LPS模型對照組小鼠肝組織中TNF-α和IL-6的mR NA表達量明顯上調（P＜ 0.05）。與LPS模型對照組相比，三葉苷低、中劑量組均可降低TNF-α和IL-6 mRNA表達水平（P＜0.05）；三葉苷高劑量組中TNF-α和IL-6的mRNA表達量與LPS模型對照組比較無顯著性差異。三葉苷低劑量組的干預效果優于三葉苷中劑量組，三葉苷低劑量組TNF-α mRNA相對表達量為LPS模型對照組的46.78%，IL-6 mRNA相對表達量為LPS模型對照組的52.68%。

2.4 免疫組化檢測小鼠肝組織中TNF-α和IL-6的蛋白水平

圖3 小鼠肝組織TNNFF--α和IL-6表達免疫組化結果（440000×）Fig.3 Immunohistochemical examination of TNF-α and IL-6 protein expression in liver (400×)

由圖3可知，與空白對照組相比，LPS模型對照組小鼠TNF-α和IL-6在肝組織細胞質內大量表達，著色效果明顯。三葉苷低、中劑量組與LPS模型對照組相比，細胞核外區域染色較淺，TNF-α和IL-6的表達降低，其中三葉苷低劑量組的抑制效果優于三葉苷中劑量組；三葉苷高劑量組與LPS模型對照組相比，TNF-α和IL-6的染色程度均無明顯差別。

3 討 論

三葉苷具有抗氧化、清除自由基的活性，是一種有一定應用潛力的抗糖尿病活性物質[14]。最新體外實驗證明，根 皮素具有抗炎癥作用，可以抑制巨噬細胞釋放TNF-α、IL-6、NO、前列腺素E2等炎癥因子及相關的細胞信號通路[15]。但三葉苷是否具有潛在抗炎癥作用尚未闡明。

注射LPS到小鼠體內能夠誘發機體炎癥反應，伴隨炎癥因子TNF-α和IL-6的大量表達[16-18]。TNF-α主要由激活的巨噬細胞分泌，在系統性炎癥反應早期大量釋放，同時 還能夠誘導其他炎癥因子的分泌。IL-6是一種多功能的細胞炎癥因子，是炎癥介質網絡的主要成分，在炎癥的發生和發展過程中起重要作用。很多植物化學物的消炎作用與降低LPS誘導的TNF-α和IL-6表達水平有關[19-20]。

本實驗利用低劑量LPS誘導小鼠炎癥反應模型，觀察多 穗柯三葉苷對LPS致小鼠炎癥反應的抗炎作用。結果表明，3 mg/（kg·d）劑量三葉苷可顯著抑制由LPS誘導的血清中TNF-α和IL-6含量的升高及其在肝組織中mRNA表達水平。同時，免疫組化結果可知三葉苷低劑量組的小鼠肝細胞中TNF-α和IL-6的蛋白水平明顯降低。根據以上結果，推測三葉苷具有減輕LPS誘導的炎癥反應的作用，三葉苷的保護作用可能是通過下調炎癥因子TNF-α和IL-6的mRNA表 達水平，進而抑制其分泌來實現的。多穗柯三葉苷抑制炎癥因子分泌的研究可為甜茶多穗柯的綜合利用和功能性食品的研發提供一定理論依據。

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Protective Effect of Trilobatin against Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Response in Mice

FAN Xia o-long1, DONG Hua-qiang2, ZHANG Y ing-hui2,*, LIU Xin1,*
(1. College of Food Science, So uth China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. College of Food and Horticultural Sciences, Foshan University, Foshan 528231, China)

This study aimed to investigate the in vivo anti-inflammatory activity of trilobatin extracted from the young leaves of Lithocarpus polystachyus Rehd on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory response in mice. After being treated intragastrically with trilobatin at three different dosage s (3, 30 and 300 mg/(kg·d)) for 3 days, the mice were administered intraperitoneally with LPS (0.1 mg/kg) 1 h after the last int ragastrical treatment on day 3. The effect of trilobatin on the expression of LPS-induced pro-inflammatory cytokines was detected. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in serum were meas ured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the mRNA expression levels of TNF-α and IL-6 in liver were assayed with real-time qu antitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). The protein levels of TNF-α and IL-6 in liver were detected by immunohistochemical strept avidin-biotin complex (SABC) method. We found that trilobatin at low dosage (3 mg/(kg·d)) significantly inhibited LPS-induced TNF-α and IL-6 production in serum, and decreased their expression in liver. These results indicate that trilobatin from Lithocarpus polystachyus Rehd has protective effect on inflammatory response in mice.

Lithocarpus polystachyus Rehd; trilobatin; anti-inflammation; lipopolysaccharide (LPS); inflammatory response

TS201.4

A

1002-6630（2014）21-0186-04

10.7506/spkx1002-6630-201421036

2014-01-17

國家自然科學基金面上項目（31071537）

范小龍（1988—），男，碩士，研究方向為食品科學。E-mail：kylexiao2011@163.com

*通信作者：張英慧（1974—），女，副教授，博士，研究方向為食品安全與營養。E-mail：zhang_ying-hui@163.com劉欣（1958—），女，教授，碩士，研究方向為食品生物化學及食品添加劑。E-mail：liuxin@scau.edu.cn