鼠曲草總黃酮抑制疼痛模型小鼠炎癥因子產生而致鎮痛作用

黃曉佳，李永金*，李 靜，許 瀟

（江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 202013）

鼠曲草總黃酮抑制疼痛模型小鼠炎癥因子產生而致鎮痛作用

黃曉佳，李永金*，李 靜，許 瀟

（江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 202013）

目的：研究鼠曲草總黃酮的鎮痛活性及其作用機制。方法：采用熱板刺激、腹腔注射醋酸法構建小鼠疼痛模型，觀察灌胃給予不同劑量的鼠曲草總黃酮對小鼠疼痛反應的作用，研究鼠曲草總黃酮對疼痛小鼠血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、一氧化氮（nitric oxide，NO）的作用，以及對腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-6、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）基因表達的影響。結果：鼠曲草總黃酮可明顯延長熱刺激引起的小鼠舔足時間，抑制腹腔注射醋酸后引起的小鼠扭體反應；降低腹腔注射醋酸致痛小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO的含量，也抑制小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-6、iNOS基因表達。結論：鼠曲草總黃酮具有鎮痛作用，其作用與減少血清中炎癥因子的產生和巨噬細胞介導的炎癥反應有關。

鼠曲草；總黃酮；鎮痛；炎癥因子

鼠曲草（Gnaphalium aff i ne D. Don）為菊科植物鼠曲草屬植物，主產于江蘇、浙江、福建等地。每年清明節前后，民間采摘其嫩葉用于制作糕點等食品。研究表明鼠曲草的主要成分包含黃酮類、揮發油等，其黃酮類成分具有抗氧化、抑菌、護肝等作用[1-4]，且毒性低，具有可觀的作為天然保健食品的開發利用價值。來自于天然產物中的黃酮類化合物具有降血糖、降血壓、抗衰老、抗炎等生物活性[5-8]，在保健食品和保健藥品中的使用日益廣泛，對黃酮類化合物的研究開發也日益增多。但目前對鼠曲草黃酮類化合物的研究仍不完全。

本實驗采用小鼠疼痛模型，研究鼠曲草總黃酮對小鼠疼痛的作用，觀察其鎮痛作用的特點，同時也測試其對小鼠血清中炎癥因子和腹腔巨噬細胞炎癥因子基因表達的作用，評價其鎮痛作用和相關機制，為有效開發鼠曲草作為保健食品和藥品提供有效的理論支持。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級雄性昆明種小鼠購自中國科學院上海實驗動物中心，飼養于江蘇大學實驗動物中心，飼養溫度25 ℃，標準飼料，自由飲水，燈光控制12 h晝夜節律；鼠曲草購自安徽亳州藥材市場。

蘆丁對照品 中國藥品生物制品檢定所；纖維素酶（1 400 U/mg） 廣州市齊云生物技術有限公司；AB-8型大孔吸附樹脂 安徽三星樹脂有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒 上海越研生物技術有限公司；NO試劑盒 南京建成生物工程研究所；mRNA提取試劑盒（含DNA酶Ⅰ消化）、小鼠TNF-α引物、IL-6引物、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）引物、親環蛋白A（cyclophilin A）引物 美國Qiagen公司；cDNA逆轉錄試劑盒美國ABI公司；其他試劑均為國產化學分析純。

1.2 儀器與設備

SENCO R201L旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司；Model 680酶標儀、S1000聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；ABI 7000定量PCR儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 鼠曲草總黃酮的制備及純度測定

鼠曲草干燥粉經過篩后，取粉末4 g于三角瓶中，加入10 mg纖維素酶和0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）使總體積為100 mL。置于50 ℃在水浴振蕩器中反應2 h后，于沸水浴中5 min終止反應，過濾，離心取上清液，合并濾液，抽濾濃縮。

使用AB-8型大孔吸附樹脂對提取的濾液進行純化，純化條件為上樣液質量濃度2.3 mg/mL，上樣液pH 4.5，流速2 BV/h；洗脫液為75%乙醇，流速為1 BV/h；回收率為80%，純化后產品純度為45%。

[2]的方法，以蘆丁作為對照品測定總黃酮的純度。稱取蘆丁標準品，加入70%乙醇溶解使其質量分數為0.60 mg/mL，以亞硝酸鈉-亞硝酸鋁比色法在510 nm波長處讀取吸光度，繪制標準曲線y=9.422 5x+ 0.162（R2=0.997 3）。取鼠尾草乙醇提取液按標準曲線繪制方法處理，于510 nm波長處測定吸光度，代入標準曲線計算總黃酮質量分數。

1.3.2 實驗動物與分組

雄性昆明種小鼠40 只，體質量（22±2）g，適應性喂養1 周后，隨機分為5 組。各組動物分組及灌胃劑量如下：生理鹽水組、阿司匹林組（300 mg/（kg·d））、鼠曲草總黃酮組（低劑量組25 mg/（kg·d）、中劑量組50 mg/（kg·d）、高劑量組100 mg/（kg·d））。

熱板法小鼠疼痛模型：給予藥物前預先測定各小鼠的痛閾值。將小鼠置于55 ℃熱板上，觀察其開始舔足的時間并予以記錄。重復測量3 次，剔除平均痛閾值＜3 s或＞30 s的小鼠，將3 次痛閾平均值作為該小鼠基礎痛閾值。之后，各組動物均進行灌胃給藥，鼠曲草總黃酮組各小鼠1 次/d，連續灌胃5 d；阿司匹林組小鼠只給予1 次藥物。末次給藥后分別在0.5、1、2 h后將小鼠置于熱板上，測定其痛閾值。

腹腔注射醋酸小鼠疼痛模型：取雄性昆明種小鼠40 只，隨機分為5 組，分組及給藥劑量同上。連續灌胃5 d，末次給藥后1 h，各小鼠均腹腔注射體積分數0.6%的醋酸溶液0.1 mL/10 g，觀察注射醋酸后20 min內各組小鼠發生扭體反應的次數。

1.3.3 血清中TNF-α、IL-6、NO含量檢測

小鼠于腹腔注射醋酸1 h后處死，取血樣進行酶聯免疫法檢測血清中TNF-α、IL-6含量。依照試劑盒說明書進行實驗操作，終止反應后，將酶標板放入酶標儀內，在450 nm波長處進行檢測，讀取吸光度。血清NO含量按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 小鼠腹腔巨噬細胞mRNA的制備及定量PCR檢測

依據文獻[9-10]方法并加以改進，進行小鼠腹腔巨噬細胞的分離。末次給藥2 h后將小鼠斷頸處死，用乙醇消毒小鼠腹部皮膚。腹腔注射5 mL無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS），輕揉腹部5 min，小心抽吸出液體，收集到離心管中。將細胞懸液4 ℃、1 500 r/min離心5 min，棄上清液收集沉淀。按照試劑盒說明書進行操作提取細胞mRNA，進行cDNA逆轉錄和定量PCR分析。

1.4 統計學分析

2 結果與分析

2.1 鼠曲草總黃酮對熱板致小鼠疼痛的作用

如表1所示，灌胃5 d后，與生理鹽水組比較，鼠曲草總黃酮（50、100 mg/kg）可顯著提高熱板導致小鼠疼痛閾值，2 種劑量藥物的作用均與阿司匹林相當。此外，灌胃給予藥物后0.5 h即開始產生作用，至2 h后仍然有效，其峰值為給藥后1 h。

表1 鼠曲草總黃酮對熱板致小鼠疼痛的作用（x±s，n＝8）Table1 Effect of total flavonoids from Gnaphalium af fi nee D. Don oonn heat-induced pain in mice ((x ±s,, n == 88))

2.2 鼠曲草總黃酮對腹腔注射醋酸致小鼠扭體反應的作用

表2 鼠曲草總黃酮對腹腔注射醋酸致小鼠扭體反應的作用（x ＝8）Table2 Effect of total flavonoids from Gnaphalium affifi ne D. Don on the writhing response in mice induced by intraperitoneal injection of acetic acid (x , = 8)

如表2所示，腹腔注射醋酸后，各組小鼠均出現扭體反應。灌胃5 d后，與生理鹽水組比較，鼠曲草總黃酮（50、100 mg/kg）可顯著減少腹腔注射醋酸導致的小鼠扭體反應次數，其作用呈現劑量依賴性，50 mg/kg劑量作用與阿司匹林相當，100 mg/kg劑量可產生比阿司匹林更強的作用（P＜0.05）。鼠曲草總黃酮（25 mg/kg）對扭體反應次數沒有影響。

2.3 鼠曲草總黃酮對腹腔注射醋酸后小鼠血清中炎癥因子的作用

圖1 鼠曲草總黃酮對小鼠腹腔注射醋酸后血清炎癥因子的作用（x±s，n＝8）Fig.1 Effect of total flavonoids from Gnaphalium af fi ne D. Don on the production of pro-inflammatory mediators in mouse plasma after administration with acetic acid (x ±s,n=8)

如圖1所示，經腹腔注射醋酸后，小鼠血清中出現大量炎癥因子，包括TNF-α、IL-6、NO。鼠曲草總黃酮（50、100 mg/kg）呈劑量依賴性地降低血清中TNF-α、IL-6、NO的含量，而25 mg/kg劑量不具有抑制血清中炎癥因子表達的作用。

2.4 鼠曲草總黃酮對小鼠腹腔巨噬細胞炎癥因子表達的作用

圖2 鼠曲草總黃酮對小鼠腹腔巨噬細胞炎癥因子表達的作用（x±s，n＝4）Fig.2 Effect of total flavonoids from Gnaphalium af fi ne D. Don on the expressions of pro-inflammatory mediators in abdominal macrophages in mice treated with acetic acid (x±s, n=4)

小鼠腹腔注射醋酸后，腹腔巨噬細胞炎癥因子表達水平增加，誘發了炎癥反應[11]。如圖2所示，鼠曲草總黃酮可劑量性地抑制巨噬細胞TNF-α、IL-6、iNOS基因表達，50、100 mg/kg劑量效果與生理鹽水組相比具有顯著或極顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。

3 討 論

疼痛是機體對損傷的一種反應，緩解疼痛的方法之一是采用藥物治療。用來篩選鎮痛藥物的動物模型有許多，其中熱板實驗可模擬熱刺激導致的疼痛，可考察中樞性鎮痛藥物的作用[12]。本實驗發現鼠曲草總黃酮對熱板引起的疼痛具有緩解作用，可明顯延長小鼠的痛閾值，其作用與阿司匹林相似，提示其鎮痛作用位點不在中樞，而在外周。此外，醋酸引起的小鼠扭體反應模型是另一種動物疼痛模型，該模型可模擬腹腔炎癥導致的病理性疼痛，已被廣泛用于非甾體抗炎藥和阿片類鎮痛藥物的篩選和作用機制研究[11]。腹腔注射醋酸后，動物出現內臟痛疼，表現為扭體反應，該反應至少持續2 h，其高峰期為0.5 h[13-14]。在本實驗也發現小鼠腹腔注射醋酸后20 min內出現多次扭體反應，鼠曲草總黃酮和阿司匹林可顯著減少該反應的次數，表現出良好的鎮痛作用。

鼠曲草中含有多種化學成分，包括黃酮類成分如蘆丁、槲皮素、槲皮素糖苷等，揮發油、氨基酸、微量金屬元素等[1]。鼠曲草主要活性成分為黃酮類化合物，目前已知鼠曲草黃酮可發揮抗氧化、抑制細菌生長、止咳祛痰、保護肝臟損傷等作用[1,8]。本實驗通過熱板法和腹腔注射醋酸法模型，證實了鼠曲草總黃酮具有鎮痛的作用，且鎮痛作用在50～100 mg/kg范圍內具有劑量依賴性，且100 mg/kg劑量的效應優于阿司匹林。此外，鼠曲草總黃酮可抑制腹腔注射醋酸后小鼠血清中炎癥因子如TNF-α、IL-6、NO的產生，也可抑制腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-6、iNOS基因表達，表明鼠曲草總黃酮的鎮痛作用來自于抑制巨噬細胞參與的機體炎癥反應。在疼痛發生過程中，各種細胞因子和致炎癥物質如TNF-α、干擾素、IL-6、NO、環氧合酶產物等都可引起痛覺的產生和傳遞過程，抑制各種細胞因子的表達則具有明顯的鎮痛效果[15-16]。而巨噬細胞是一種重要的炎癥因子產生細胞，其分泌的各種致炎因子可導致血管通透性增加、中性粒細胞滲出、組織浸潤、痛覺受體增敏和與痛覺有關細胞內信號的啟動，引起機體疼痛的感覺[17-18]。研究已表明，抑制巨噬細胞產生和分泌炎癥因子，降低血液中炎癥因子水平可明顯減低小鼠扭體反應次數，二者具有良好的相關性[19-22]。因此，通過抑制巨噬細胞的活化及分泌炎癥因子，進而減輕機體炎癥反應是一種可行的鎮痛藥物的研發思路。

綜上所述，本實驗通過小鼠疼痛模型，證實了鼠曲草總黃酮的鎮痛作用，且該作用與其抑制巨噬細胞產生炎癥因子，減低機體炎癥反應有關。我國鼠曲草資源豐富，在保健食品和藥品開發上具有一定的價值。目前，國內外研究已經初步表明鼠曲草黃酮類物質可能的作用，但其生物活性成分仍需進一步研究，為其作為功能性食品或藥品的開發提供理論基礎。

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Total Flavonoids from Gnaphalium aff i ne D. Don Exert Analgesic Effect via Inhibiting the Production of Pro-inflammatory Mediators in Mouse Model of Pain

HUANG Xiao-jia, LI Yong-jin*, LI Jing, XU Xiao
(School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 202013, China)

Objective: To investigate the anti-nociceptive effect of total fl avonoids from Gnaphalium aff i ne D. Don and the involved mechanism. Methods: Employing the mouse model of pain induced by heat and intraperitoneal injection of acetic acid, the analgesic activity of oral administration of the total fl avonoids was assessed. Moreover, the production of cytokines in mouse plasma, including tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and nitric oxide (NO) was determined. The gene expression levels of TNF-α, IL-6 and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in peritoneal macrophages were also examined. Results: The total fl avonoids signif i cantly increased the withdrawal latency in hot plate tests and inhibited the writhing response in mice. In addition, the total fl avonoids blocked the production of TNF-α, IL-6, and NO in plasma and reduced the expression levels of TNF-α, IL-6, and iNOS in the peritoneal macrophages. Conclusions: The total fl avonoids from Gnaphalium aff i ne D. Don exert analgesic effects in mice, which is associated with the inhibition of the production of cytokines in plasma and macrophage-mediated inf l ammation.

Gnaphalium aff i ne D. Don; total fl avonoids; analgesic effect; pro-inf l ammatory mediator

R285.5

A

1002-6630（2014）21-0240-04

10.7506/spkx1002-6630-201421047

2014-01-16

江蘇大學高級人才啟動基金項目（08JDG005；11JDG092）

黃曉佳（1980—），男，講師，博士，研究方向為中藥藥理學和抗腫瘤藥物藥理學。E-mail：harold1980@163.com

*通信作者：李永金（1968—），男，副教授，博士，研究方向為天然藥物藥理學。E-mail：lyj8617@163.com