活性氧影響拮抗菌及果蔬采后抗病性的研究進展

李超蘭，楊其亞，張紅印*，張曉云

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013）

活性氧影響拮抗菌及果蔬采后抗病性的研究進展

李超蘭，楊其亞，張紅印*，張曉云

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013）

活性氧引起的氧化脅迫作用作為生防系統中常見的影響因素引起了廣泛的關注。活性氧作為生物體內的必須物質，是維持生命活動必不可少的內源性成分；但當其過量時，會損害大分子蛋白、核酸等有害物質，又必須被有效地清除。因此如何利用活性氧在生物防治系統中的重要作用是提高生防效果的方法之一。本文通過介紹活性氧的產生以及清除，系統地闡述了活性氧-氧化脅迫，氧化脅迫-拮抗菌以及氧化脅迫-果蔬之間的相互作用，并論述活性氧對拮抗菌生防能力以及果蔬抗病性帶來的積極、消極作用，進一步探討相關作用對于生防效果的影響。

氧化脅迫；活性氧；拮抗菌；果蔬；病害；生物防治

果蔬采后病害造成的損失是巨大的。導致果蔬采后損失的因素很多，病原菌侵染引起的腐爛是造成果蔬采后損失的主要原因，病原真菌對采后水果的危害不僅在于其導致水果在數量上的嚴重損失，而且許多病原真菌尤其是霉菌能分泌產生許多次生代謝產物，從而引起嚴重的食品安全問題，如曲霉菌（Aspergillus flavus、Aspergillus parasiticus等）產生的黃曲霉毒素、擴展青霉（Penicillium expansum）產生的棒曲霉素（patulin）等。

隨著國家經濟發展和消費水平的提高，人們對食品安全和環境保護意識日益增強，研究并開發替代化學殺菌劑的安全、無毒、高效的新型水果采后病害防治方法，具有重大的社會意義和廣闊的應用前景[1-2]。當前國際上越來越重視水果采后病害生物防治的研究，并認為這是最有希望取代化學殺菌劑的方法之一[3-4]。

縱觀國內外市場，果蔬采后病害生防拮抗劑制品仍然很少，其主要原因是拮抗菌在實際運用時生防效力不高。環境是影響拮抗菌在生產及應用過程中生存和生防效力的重要因素，而氧化脅迫則是最常見的環境影響因素之一，在病原菌、拮抗菌、果蔬三者構成的生防系統中扮演著重要的角色。本文論述了活性氧對拮抗菌防治果蔬采后病害效果的影響。

1 氧化脅迫與活性氧

氧化脅迫，是機體氧化和抗氧化過程中發生的不平衡狀態[5]。在生物體中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生和清除系統的失衡引發ROS增加，過多的ROS將導致氧化脅迫。ROS是主要的促氧化劑，它主要包括超氧化物、過氧化氫（hydrogenperoxide，H2O2）和羥自由基（·OH）等，它們都具有高活性和毒性。過多的活性氧會引發氧化脅迫作用，從而對細胞產生損害[6]。H2O2作為重要的活性氧分子，是導致氧化脅迫的重要因素，可引起許多生物大分子的損害，如導致磷脂的過氧化而破壞生物膜系統；促進二硫鍵的形成，從而使含巰基的酶類失活等。H2O2還是抗氧化脅迫反應中重要的信號分子，引發抗氧化級聯反應[7]。這些氧化脅迫作用會對細胞的生理機制和細胞膜的完整性造成損害，從而導致細胞死亡[8]。

2 活性氧的清除

為了避免氧化還原狀態失衡，在生物體內會有一系列的生化反應機制，包括抗氧化酶作用以及非酶作用，從而將活性氧轉化為對細胞無害的物質[9]。

2.1 酶防御系統

生物體在進化過程中形成了完善的ROS清除酶系統，是細胞適應惡劣環境下的最重要的方式。酶防御系統不僅可以直接清除進入細胞內的氧化劑，逆轉損害的蛋白質和核酸，也可以將非酶防御體系維持在較高抗氧化水平[10]。如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）。通過這些抗氧化酶作用可以使活性氧的濃度處于一個相對平衡的狀態[11-12]。SOD是一種含金屬的、能夠清除生物體內超氧陰離子自由基（O2-·）的酶，SOD催化兩個O2-·發生歧化反應，生成H2O2和O2-·[13-14]。CAT是一種包含血紅素的四聚體酶，它可將H2O2迅速分解為H2O和O2，從而降低過氧化氫對細胞的毒害作用[14]。POD的作用具有雙重性，一方面，POD 可在逆境或衰老初期表達，清除H2O2，對細胞產生保護作用，為抗氧化系統的成員之一[12]；另一方面，POD也可在逆境或衰老后期表達，參與活性氧的生成，并引發膜脂質過氧化作用，產生不利影響； POD甚至可作為衰老指標[15-16]。除此之外，常見的抗氧化酶還包括谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）等。它們均能有效地清除細胞內的多余活性氧，使之處于相對平衡的狀態，從而對細胞產生保護作用。

2.2 非酶防御系統

除卻抗氧化酶作用，非酶作用也是在氧化脅迫作用下一大重要的細胞保護作用。主要包括一些水溶或脂溶性小分子，如蛋白質、氨基酸衍生物、維生素、脂肪酸、糖類和起緩沖平衡調節作用的離子，它們可以從溶液中直接清除氧化產物[10]。其中常見的起保護作用的物質包括海藻糖，谷胱甘肽（glutathione，GSH）。海藻糖最初于1882年從黑麥的麥角菌中分離出來，后來研究發現它是一種廣泛存在于植物、細菌、真菌和無脊椎動物體內的非還原性的雙糖[17]。海藻糖往往是在環境脅迫條件下產生，含量可隨外界環境條件的變化而變化，是一種應激代謝物。海藻糖具有保護生物細胞和生物活性物質在脫水、干旱、高溫、冷凍、高滲透壓及有毒試劑等不良環境條件下活性免遭破壞的功能。海藻糖對生物體組織和生物大分子具有非特異性保護作用，外源性的海藻糖同樣對生物體和生物大分子有良好的非特異性保護作用。對于海藻糖的作用機制主要有以下3 種假說：“水替代”假說、“玻璃態”假說、“優先排阻”假說[17]。酵母細胞中最豐富最重要的抗氧化劑分子是氨基酸衍生物——GSH。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽。它與超氧基團作用產生還原型谷胱甘肽來發揮抗氧化功能，保護線粒體免受氧化劑的損傷，同時也可以憑借GSH 偶合泵（Ycf1p），偶聯進入液泡的鎘、甲萘醌等毒性親電子試劑，進行解毒[18]。而還原型GSH是含巰基的低分子肽，為機體內的重要活性物質，參與二硫化物、硫醚和硫酯的形成，并能清除生物體內的自由基從而解除毒性[7]。

因此誘導細胞抗氧化酶活性的提高和非酶作用的增加是減少氧化損傷的有效途徑[7]。通過應用分子遺傳學、細胞生物學、蛋白質組學和功能基因組學等技術手段，誘導抗氧化相應蛋白的表達，提高抗氧化能力；添加外源物質提高生物體內抗氧化酶活性或抗氧化物質含量。

3 拮抗菌與氧化脅迫之間的相互作用

3.1 拮抗菌內活性氧的產生及其危害

正常需氧條件下，酵母細胞中的代謝副產物會產生超氧負離子、羥基和過氧化氫等內源活性氧族物質（ROS）。外界環境中的電離輻射、氧化還原劑或重金屬等也能刺激細胞產生這些活性氧形態。而要將生防菌產業化，自然會遇到一系列問題，其中包括不同環境條件對拮抗菌生存以及生防效果的影響。氧化脅迫就是最常見的環境問題，因此也在生物防治系統中起著重要作用[19-20]。在拮抗劑的運用過程中，無論是果蔬傷口組織還是表面都會積累大量活性氧即ROS，例如過氧化氫、超氧陰離子，從而影響宿主生理機制，病原菌毒力，酵母生存能力，生防效力等[20-21]。有研究報道隨著氧化脅迫作用的加強，拮抗菌Rhodotorula glutinis的生存能力逐漸降低[19]；Pati?o-Vera等[22]報道接抗菌Rhodotorula minuta在液態貯藏期間，氧化脅迫能影響其生存能力。

當酵母菌受到強烈的氧化脅迫作用，細胞中累積的活性物質超過了細胞氧化物質清除的平衡能力，就會損害到DNA、脂質和蛋白質等細胞組分，進而影響細胞的功能甚至造成細胞死亡[23]。

3.2 拮抗菌內活性氧的清除機制

在氧化脅迫作用下，酵母細胞已經形成一整套完整機制來保護細胞組分免受氧化脅迫的毒害作用。酵母細胞非酶防御系統主要包括一些水溶或脂溶性小分子，如氨基酸衍生物、蛋白質、脂肪酸、糖類、維生素以及起緩沖平衡調節作用的離子，它們可以從溶液中直接清除氧化產物[10]。酵母細胞中最重要的抗氧化劑分子是氨基酸衍生物——GSH和多胺（polyamine）[10]。除此之外，酵母細胞內一定含量的海藻糖能還原被氧化劑誘導后發生的蛋白質修飾，減少脂質過氧化水平[24]。而酵母細胞內的酶作用主要有過氧化物歧化酶系，硫氧還蛋白過氧化物酶/硫氧還蛋白還原酶系能還原過氧化氫和烷基過氧化氫，谷胱甘肽還原酶/谷胱甘肽氧化物酶系還原氧化的谷胱甘肽，維持細胞內的還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的平衡[10]。

酵母細胞在組織形成最前線抗氧化防御屏障的同時，會將壓力信號逐級傳遞到細胞核內，使細胞在更高的層級上對氧化脅迫做出更為精細的調控[10]。基因水平上的調控則是細胞盡快適應氧化脅迫環境最重要的策略方式。

在氧化脅迫條件下，細胞將激活應激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）級聯反應途徑，氧化脅迫相關基因表達上調。而細胞正是利用相關基因表達水平的改變來調控其抗氧化性能[25]。

圖1 酵母細胞抗氧化脅迫應答示意圖[[1100]]Fig.1 Response of yeast cells to oxidative stress[10]

如圖1所示，細胞主要是通過以下幾個途徑對相關基因表達進行調控。

一方面，SAPK途徑上游的卟啉型蛋白磷酸酶可以磷酸化激酶結構域中的組氨酸殘基，而磷酸化基團隨后轉到效應調節蛋白結構域中的天冬氨酸殘基上，該效應調節蛋白含有DNA結合結構域從而發揮轉錄因子的作用[10]。在氧化應激應答中，磷酸基團通過 Sln1-Ypd1-Skn7進行轉移，感應調節蛋白Skn7在過氧化氫和二酰胺抗性中發揮調控作用。除此之外，Skn7p還調控著許多抗氧化應激反應基因的表達，如TRR1。另一方面，酵母中的類AP（activation protein）轉錄因子Yap1p和其他類型的轉錄因子可以直接或間接地調控著相關基因的表達。Yap1p能通過形成二硫鍵來改變蛋白質構象，對其活性和持續性起著重要作用[27]。研究表明Yap1p也和Skn7p一起協同調控細胞抗氧化脅迫中一系列的重要靶基因[28]。

與此同時，銅離子結合蛋白Ace1p和Mac1p的氧化還原活性，在細胞傳感氧化劑信號中起著重要作用[29]。鋅指型轉錄激活因子Hap1p涉及到SOD2基因的轉錄調控[30]。轉錄抑制因子Xbp1p的表達受到包括氧化脅迫在內的許多環境因素的調控，它可能通過基因表達抑制來調節保守蛋白質還原水平[31]。

3.3 活性氧刺激與拮抗菌細胞內信號反饋

活性氧作為信號分子具體傳遞途徑包括以下三方面。

3.3.1 作為信號分子調節蛋白質的磷酸化與脫磷酸化

無論是外源活性氧或細胞內產生的活性氧常會引起細胞內某些蛋白激酶或磷酸酶活性的變化，激發信號傳遞，從而發生一系列磷酸化、脫磷酸化反應。如表皮生長因子與其受體結合誘導生成的H2O2激活蛋白酪氨酸激酶，而在同一刺激下誘導生成的O2-?抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的活性[32]。

3.3.2 調節Ca2+信號

細胞內游離Ca2+濃度的變化與細胞的多種生物學效應密切相關。報道表明，細胞內質網上與鈣離子通道相關的三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-triphosphate，IP3）受體和Ryanodine受體及Ca2+-Na+交換體都受氧化還原的調控[33]。

3.3.3 活性氧作為信號分子介導轉錄因子的激活

通過信號級聯放大作用，由轉錄因子的蛋白質傳遞到細胞核誘導特異基因表達，使得細胞外信號向細胞內傳遞。而活性氧可以調控轉錄因子的激活。資料表明，轉錄因子NF-κB未激活時是由3個亞基組成的三聚體，其中一個IκB亞基起抑制活性作用。將轉錄因子進行活化時，需講解IκB，而后NF-κB則由兩個亞基P50/P65組成。活性氧，H2O2和O2-?，能激活NF-κB，活化的NF-κB可與DNA結合誘導特異基因的表達[34-35]。

3.4 拮抗菌和氧化脅迫

在過去的生防菌機制研究中，營養與空間的競爭被認為是最主要的競爭機制之一。 拮抗菌在果蔬傷口處的生長增殖能力對采后生物防治來說具有重要意義[36-37]。在實際運用過程中，果蔬傷口處微生物的增長必須適應氧化脅迫的條件。如何提高拮抗菌氧化脅迫耐受性、從而能在傷口處迅速增殖是生物防治的關鍵問題[19]。Liu Jia等[38]曾報道甘氨酸甜菜堿能提高拮抗菌Cystofilobasidium inf i rmominiatum氧化脅迫耐受性，并進一步提高其生防效果。與此同時，外源鈣離子的添加能誘導抗氧化酶活性的提高，ROS積累量的減少，其氧化傷害降低，存活率增加，從而能提高其生防效果[39]。因此，提高拮抗菌氧化脅迫耐受性是維持或增強其拮抗效力的有效方法。

4 果蔬與氧化脅迫之間的相互作用

4.1 果蔬組織內活性氧的產生及其作用

采后病原真菌主要通過組織傷口入侵果蔬組織。病原菌的入侵導致植物傷口處磷脂酶活性增加，并產生大量的活性氧，包括自由基、活性氧、超氧陰離子、過氧化氫[40-42]。過量活性氧以及自由基會引起氧化脅迫，從而對生物體產生不利影響，會對植物細胞造成一定的傷害，如DNA損傷，蛋白的變性及脂類的過氧化等，引發宿主細胞的凋亡[43]。Castoria等[19]報道當蘋果受到損傷，在傷口處會立即產生大量的活性氧，并在此后的4 h內活性氧會持續產生。而存放時間較長的蘋果產生過氧化氫和超氧陰離子的速率要快于新鮮蘋果。研究顯示在梨的成熟過程中，自由巰基含量降低，過氧化氫和脂質過氧化物含量則增加[19]。

雖然高濃度的ROS對植物組織細胞會有不利的作用，破壞部分蛋白質結構，干擾細胞正常的信號傳遞過程，并產生毒性。但研究表明ROS可在低濃度時作為信號傳導的小分子。ROS在植物與病原菌的相互作用中尤其是早期階段能最為重要的第二信使。研究表明，H2O2在抗病信號傳導中處于水楊酸（salicylic acid，SA）的下游，并能誘導病程相關蛋白的表達[44]。因此，H2O2可以作為局部和系統的信號分子誘導植物的抗病性。ROS的生成，能使植物獲得對多種脅迫的高抗性。因此，ROS在植物抗逆信號傳導中有著重要的作用。另一方面，在超敏反應（hypersensitive response，HR）過程中，病原菌侵入點附近的組織細胞會產生大量的氧化性物質，導致病原菌細胞的程序性死亡，從而抑制了病原菌的侵染[19]。

4.2 果蔬組織內活性氧的清除機制

果蔬組織內的抗氧化防御系統是由一些清除活性氧的酶系和抗氧化物質組成，包括SOD、POD、CAT和抗壞血酸等[45-46]。在整個植物的抗氧化酶促系統中，SOD組成了植物體內抗氧化脅迫的第一道防線。POD的主要作用是將植物體過多的H2O2還原為H2O和O2，降低活性氧對植物的危害。CAT的主要作用也是清除氧代謝中產生的H2O2以及由此產生的有機過氧化物[47-48]。

4.3 果蔬和氧化脅迫

當外源微生物侵染果蔬宿主，在強烈的氧化爆發（oxidative burst，OB）發生之前會產生活性氧[49]。因此，階段性氧化爆發，氧化性分子物質的增加是果蔬-微生物相互作用中宿主具有抵抗力的關鍵因素[50]。與此同時，強烈的氧化爆發與病原菌直接或間接抑制宿主細胞內氧化物質的積累有重要作用[51-52]。

研究表明通過添加外源活性氧濃度調節器或過氧化氫可以增強宿主對病原菌的抗性[53]。而包括酶作用以及非酶作用在內的活性氧清除機制的大量啟動，會降低宿主自身抗病性[54]，該作用在蘋果[21]、芒果[55]、柑橘[52]、草莓[53]和梨[56]的采后病害相關研究中已被證實。與此同時，微生物也能通過誘導宿主組織內活性氧的積累來提高其抗病性。拮抗真菌Trichoderma virens能通過一分子質量12.5 kD的多肽引發大米和棉花組織內產生一系列蛋白效應，誘導宿主產生過氧化氫并使其相關防御基因產生表達[57]。因為在植物抗病系統中，木質素的生物合成[58]，熱激轉錄因子的誘導[59-60]，PR基因的積累[61]，以及抗菌物質的產生都對其抗病性產生極大的影響[62]，而在這些反應過程中，過氧化氫均擔任著重要的角色。Droby等[3]曾提出拮抗酵母通過誘導水果組織產生ROS從而來提高其抗病性也是生物防治一大機制。

因此我們可以推測，果蔬組織內適量ROS的產生能誘導其抗病性的提高，并在采后病害控制中發揮重要作用，但其具體機制仍需進一步的研究。

5 控制采后病害的過程中，活性氧/氧化脅迫的作用

研究表明通過提高果蔬自身抗病性以及拮抗菌拮抗效力等方法能夠降低果蔬病害發生率。當活性氧濃度較高時，產生強烈的氧化脅迫作用，造成果蔬組織和拮抗菌細胞內氧化還原狀態失衡，對其產生毒害作用，如蛋白質，核酸變性[23,44]，以致拮抗菌生存能力下降，營養空間競爭能力下降，拮抗能力降低，從而導致高的果蔬采后病害發生率。當活性氧濃度較低時，適宜濃度的活性氧會作為第二信使誘導宿主抗病性的提高，抑制病原菌的侵染，從而降低果蔬采后病害發生率[44]。因此提高拮抗酵母對氧化脅迫的耐受性以及運用低濃度活性氧提高果蔬抗病性有望成為降低其采后病害發生率的有效方法[63-64]。

6 結 語

當宿主果蔬受到外界脅迫或者非脅迫作用，包括病原菌的入侵時，會產生大量的活性氧，從而對宿主和拮抗菌產生氧化脅迫作用。過多的活性氧會影響拮抗菌的生存能力，而低劑量的活性氧能提高果蔬抗病性。因此，氧化脅迫在生防系統中扮演著重要的角色。迄今為止，研究多存在于拮抗菌-氧化脅迫，果蔬-氧化脅迫兩方面，如何處理三者之間的關系，從而獲得更好的生防效果仍需進一步研究。

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Progress in Understanding the Effect of Reactive Oxygen Species on Antagonist and Postharvest Disease Resistance of Fruits and Vegetables

LI Chao-lan, YANG Qi-ya, ZHANG Hong-yin*, ZHANG Xiao-yun (College of Food Science and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Oxidative stress induced by ROS (reactive oxygen species) as a key factor in bio-control system has gained tremendous attention. ROS, on the one hand, it is necessary for sustaining life activity; on the other hand, it is harmful to cellular protein and DNA so that it should be scavenged. How to utilize ROS effectively during the process of bio-control to enhance controlling efficiency is highly desired. This paper summarizes the mechanisms of ROS generation and scavenging, expounds the interactions of oxidative stress with ROS, antagonist and host vegetables and fruits, and discusses the positive and negative impact of ROS on postharvest disease resistance in vegetables and fruits as well as the influence of relevant actions on the bio-control efficiency.

oxidative stress; ROS; antagonist; fruits and vegetables; postharvest disease; bio-control

TS201.3

A

1002-6630（2014）21-0264-06

10.7506/spkx1002-6630-201421052

2013-11-10

國家自然科學基金面上項目（31271967）；教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目（20123227110015）

李超蘭（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物學。E-mail：dearlanli@163.com

*通信作者：張紅印（1972—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物學。E-mail：zhanghongyin126@126.com