枸杞多糖對肝癌模型小鼠腫瘤抑制與免疫功能的影響Δ

肖佩玉，萬正蘭，黃際薇（1.中山大學附屬第三醫院藥劑科，廣州 510630；.中山大學附屬第五醫院藥學部，廣東珠海 510630）

原發性肝癌炎癥危害人類生命健康，我國是肝癌高發地區，每年死于肝癌的患者超過11萬[1]。由于該疾病早期臨床癥狀不典型，患者發現時大多數已屬晚期，失去了手術治療最佳時機，因此患者病死率極高，預后效果較差[2]。晚期肝癌患者臨床常用的治療方法為放化療，但放化療的毒副作用較大，導致部分患者不耐受而影響治療效果。枸杞多糖是從枸杞子中提煉出來的蛋白多糖，近代藥理學研究指出，枸杞多糖具有抗基因突變、抗腫瘤、調節機體免疫力、抵抗病毒及感染等多種生物活性功能[2]。枸杞多糖不僅能直接殺死腫瘤細胞，同時可與中間宿主產生生物學效應，通過多途徑作用于免疫細胞，增加抗體分泌，提高機體免疫功能，從而起到殺滅及抑制腫瘤細胞的作用[3]。為此，本研究通過復制H22肝癌小鼠模型，以探討枸杞多糖抑制腫瘤與提高機體免疫力的作用。

1 材料

1.1 儀器

BLXK-JA3003B型電子天平（上海鑫倉電子科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

枸杞多糖（西安森冉生物工程有限公司，批號：20081201，含量：＞30%）；環磷酰胺（山西普德藥業有限公司，批號：20090103）；甲胎蛋白（AFP）測試盒（北京倍愛康生物技術股份有限公司）；鐵蛋白（SF）、癌胚抗原（CEA）測試盒（天津中新科炬生物制藥有限公司）；白細胞介素（IL）-2、腫瘤壞死因子（TNF）-α、γ干擾素（INF-γ）酶聯免疫（ELISA）測試盒均購于上海森雄科技實業有限公司。

1.3 動物與瘤株

2 方法

2.1 模型的復制

將經三代細胞傳代培養的H22瘤株經腹腔接種到KM小鼠體內，并于接種后7 d選擇腹水飽滿、精神狀態良好的小鼠采用頸椎脫臼處死，消毒腹腔部位后抽取小鼠腹部乳白色腹水作為腫瘤源，并用無菌生理鹽水將腫瘤細胞懸液稀釋為原來的3倍，經常規消毒后將0.2 ml懸液皮下接種于小鼠右前肢腋窩，以復制小鼠肝癌模型。

2.2 分組與給藥

20只KM小鼠隨機均分為4組，即正常對照（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組、環磷酰胺（20 mg/kg）組、枸杞多糖（5 mg/kg）組。ig給藥，每天1次，連續10 d。

2.3 指標的檢測

2.3.1 體質量的稱定 每天上午8：00～10：00稱取小鼠去除瘤體后的純體質量。

2.3.2 抑瘤率的計算 稱定腫瘤質量，并根據公式計算抑瘤率：抑瘤率（%）＝[1－（用藥組平均瘤質量/模型組平均瘤質量）]×100%。

2.3.3 血清腫瘤標記物的測定 空腹靜脈抽取小鼠血液3 ml，常規離心得血清，采用ELISA法測定血清腫瘤標記物。

2.3.4 炎癥因子的測定 空腹靜脈抽取小鼠血液3 ml，常規離心得血清，采用ELISA法測定小鼠血清IL-2、TNF-α、INF-γ含量。

2.3.5 自然殺傷（NK）細胞活性的測定 采用MTT法測定NK細胞活性。NK細胞活性（%）＝[靶細胞吸光度－（用藥組吸光度－效應細胞吸光度）]/靶細胞吸光度×100%。其中，效應細胞為脫頸椎處死小鼠去脾臟研磨制成單細胞懸液，經200目篩網濾過，Hanks液洗3次，用RPMI1640培養液制成細胞懸液，用臺酚藍染色計數活細胞數在95%以上，并調整細胞密度為5×106ml－1；靶細胞為將連續傳代培養的胞株為靶細胞，活細胞數在95%以上、細胞密度調為2.5×105ml－1。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 枸杞多糖對模型小鼠體質量的影響

給藥第5、10天，與正常對照組比較，模型組小鼠體質量減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組小鼠體質量增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。枸杞多糖對模型小鼠體質量的影響見表1。

表1 枸杞多糖對模型小鼠體質量的影響（）Tab 1 Effects ofL.chinensis polysaccharides on body weight in model rats（）

表1 枸杞多糖對模型小鼠體質量的影響（）Tab 1 Effects ofL.chinensis polysaccharides on body weight in model rats（）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.2 枸杞多糖對模型小鼠抑瘤率的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠瘤質量增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組小鼠瘤質量減少（抑瘤率為62.98%），差異有統計學意義（P＜0.05）。枸杞多糖對模型小鼠抑瘤率的影響見表2。

表2 枸杞多糖對模型小鼠抑瘤率的影響（）Tab 2 Effects ofL.chinensis polysaccharides on tumor inhibition rate in model rats（）

表2 枸杞多糖對模型小鼠抑瘤率的影響（）Tab 2 Effects ofL.chinensis polysaccharides on tumor inhibition rate in model rats（）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.3 枸杞多糖對模型小鼠血清腫瘤標記物水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清AFP、CEA含量增加，SF含量減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組小鼠血清AFP、CEA含量減少，SF含量增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。枸杞多糖對模型小鼠血清腫瘤標記物水平的影響見表3。

表3 枸杞多糖對模型小鼠血清腫瘤標記物水平的影響（）Tab 3 Effects ofL.chinensis polysaccharides on serum tumor markers in model rats（）

表3 枸杞多糖對模型小鼠血清腫瘤標記物水平的影響（）Tab 3 Effects ofL.chinensis polysaccharides on serum tumor markers in model rats（）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.4 枸杞多糖對模型小鼠血清細胞因子水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清IL-2、IFN-γ含量減少，TNF-α含量增加，NK細胞活性減弱，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組小鼠血清IL-2、IFN-γ含量增加，TNF-α含量減少，NK細胞活性增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。枸杞多糖對模型小鼠血清細胞因子水平的影響見表4。

表4 枸杞多糖對模型小鼠血清細胞因子水平的影響（）Tab 4 Effects ofL.chinensis polysaccharides on inflammatory cytokines levels in model rats（）

表4 枸杞多糖對模型小鼠血清細胞因子水平的影響（）Tab 4 Effects ofL.chinensis polysaccharides on inflammatory cytokines levels in model rats（）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

4 討論

腫瘤的發生及發展是非常復雜的過程，目前關于腫瘤的作用機制還有待進一步研究，但已有研究指出，腫瘤的發生、進展、預后與機體免疫狀況有密切關系，腫瘤患者普遍存在免疫功能低下的情況[4]。機體免疫狀況對對抗腫瘤侵襲、抑制腫瘤生長具有重要意義。

枸杞多糖是從植物枸杞子中提煉的活性成分，相關研究表明，其具有抗病毒、調節機體免疫、抗腫瘤、降血糖血脂、清除機體自由基與延緩衰老等功能[5]。枸杞多糖對機體免疫功能的調節，能通過與中間宿主產生生物學效應而起到間接抑制或殺傷腫瘤的目的[6]。枸杞多糖可通過多層面及多途徑調節機體免疫系統，從而激活巨噬細胞、T淋巴細胞、樹突狀細胞等免疫細胞而起到免疫調節功能。此外，枸杞多糖能通過刺激NK細胞大量分泌IFN-γ，增加巨噬細胞免疫殺傷功能，調節機體免疫系統，增強機體抗腫瘤作用[7-8]。

本研究中對H22肝癌小鼠ig枸杞多糖，通過研究發現，枸杞多糖具有明顯抑制腫瘤的作用。枸杞多糖組小鼠平均瘤質量低于模型組，而抑瘤率則高于環磷酰胺組，環磷酰胺作為廣譜抗癌藥物具有較強的抑制腫瘤作用，但其在殺傷癌癥細胞的同時也會對機體正常細胞產生較大的損害作用，增加患者不良反應率。蔣艷等[9]研究指出，通過檢查腫瘤血清標記物可以有效評價藥物抑瘤作用。CEA是由腸黏膜釋放的，進入循環后其將會被肝臟吸收并分解，當肝臟受損時，CEA的分解能力將受到影響，從而導致血液中CEA的水平上升[10]。SF是血清中的鐵蛋白質，其生成及合成是由肝臟細胞生成的，當肝臟細胞受損時，會導致鐵蛋白的合成受阻，使得血液中SF含量升高。AFP是肝組織出現大規模壞死后釋放到血清中的物質，因此通過對三種標記物進行測定能有效預測肝癌的進展程度。本研究枸杞多糖組小鼠血清AFP、CEA低于模型組，而SF高于模型組，從而說明枸杞多糖能有效抑制腫瘤生長。鄧自輝等[11]研究認為，腫瘤的發生與機體免疫力失衡有關，通過增強機體免疫力可有效抵抗腫瘤。本研究枸杞多糖組NK細胞活性、IL-2、INF-γ含量高于環磷酰胺組，而TNF-α含量低于環磷酰胺組，差異有統計學意義（P＜0.05），其結果與楊書良等[12]報導一致。原因可能與枸杞多糖如下作用機制有關：（1）增加T淋巴細胞及淋巴細菌亞群，增強淋巴細胞轉化率。（2）通過調節小鼠巨噬細胞，釋放可溶性因素及抗原從而起到抑制腫瘤的作用。（3）枸杞多糖刺激NK細胞釋放，增加NK細胞殺傷腫瘤活性，溶解腫瘤細胞，增加白細胞，降低IL，誘導干擾素生成，促進腫瘤細胞與巨噬細胞結合，從而產生特異性免疫殺傷腫瘤細胞，起到抑制腫瘤的作用。

[1]張鳴號，王秀玉，王秀梅，等.枸杞多糖對小鼠移植性肝癌抑制作用的實驗研究[J].中草藥，2012，（6）：1 142.

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[3]郝習，趙明耀，楊紅艷，等.枸杞多糖對荷H22肝腹水瘤小鼠免疫功能的影響[J].鄭州大學學報：醫學版，2011，46（2）：242.

[4]佘燕玲，何彥麗，杜標炎，等.枸杞多糖聯合趨化因子對肝癌小鼠T輔助淋巴細胞分化的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（7）：208.

[5]劉靜.枸杞多糖對小鼠移植性肝癌抑制作用的實驗研究[J].陜西中醫，2013，34（8）：1 079.

[6]成日華，李煥德.枸杞多糖抗腫瘤機制研究進展[J].中南藥學，2011，9（12）：921.

[7]郝習，趙明耀，董子明，等.靈芝多糖和枸杞多糖聯合應用對荷瘤小鼠抗腫瘤活性和免疫功能的影響[J].中醫研究，2011，24（5）：33.

[8]張鳴號，王秀玉，王秀梅，等.枸杞多糖對小鼠移植性肝癌端粒酶活性及hTERT蛋白表達的影響[J].時珍國醫國藥，2012，23（10）：2 438.

[9]蔣艷，姜孝新.枸杞多糖對肝癌Hca-F荷瘤小鼠的抗腫瘤作用及其機制[J].腫瘤藥學，2011，01（4）：391-394.

[10]章培軍，邢雁霞，劉斌鈺，等.枸杞多糖對實驗性肝損傷保護作用的研究[J].中國藥物與臨床，2011，11（11）：1 286.

[11]鄧自輝，牛陽，王榮，等.枸杞多糖藥理作用的研究現狀[J].臨床合理用藥雜志，2011，04（35）：164.

[12]楊書良，郝玉栓，單鐵英，等.口服枸杞多糖對實驗性食管癌大鼠免疫功能影響的研究[J].中國實驗診斷學，2012，16（6）：986.