正交試驗優選槐角中山奈酚的提取工藝

馬 敏，王 莉，李 芳，王衛峰#（1.陜西中醫學院藥學院，陜西咸陽 71046；.陜西省食品藥品檢驗所，西安 710065；.陜西省中醫藥研究院，西安 71000）

槐角為豆科植物槐Sophora japonicaL.的干燥成熟果實，性寒、味苦，歸肝、大腸經，有清熱瀉火、涼血止血之功效[1]。槐角中含有多種以苷類形式存在的黃酮類化合物，其基本的苷元有4種，即槲皮素、染料木素、山奈酚和異鼠李素[2]，本研究將山奈酚含量作為評價指標。山奈酚又稱山奈素、4′，5，7-三羥基黃酮醇等，主要是3位或3，7位成苷而在山奈、槐角、銀杏葉、金錢草中普遍存在的黃酮醇類化合物，在槐角中含量最高，其藥理作用主要有抗氧化、抗炎、抗輻射和預防心血管疾病等藥理活性[3]。

筆者擬找到一條工藝合理、操作簡單和成本低兼的水浸提法從槐角中將山奈酚提取出來，為工業化提取提供更多的選擇。本研究參考有關文獻[4-8]，采取正交試驗法，研究了各個影響因素，確定了槐角中山奈酚提取工藝的最佳條件。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC H-Class型超高效液相色譜儀，包括四元高壓梯度泵、自動進樣器、PDA檢測器、柱溫箱、EmpowerTM3色譜工作站（美國Waters公司）；BP211D型電子分析天平（德國賽多利斯天平有限公司）；98-1-B型電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；Synergy UV型超純水器（美國Millipore公司）。

1.2 藥材

槐角購于陜西省藥材公司，經陜西省中醫藥研究院王衛峰研究員鑒定為真品。

1.3 試劑

山奈酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110861-200304）；乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 水提取工藝

稱取干燥槐角50 g，按正交試驗設計方案，依次加熱回流水煎煮，濾過，合并濾液，加熱濃縮至200 ml，得提取液，貯藏，備用。

2.2 山奈酚含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液（23 ∶77，V/V）；檢測波長：370 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.3 ml/min；進樣量：1.0 μl。在此條件下山奈酚與其他組分可達到基線分離，理論板數按山奈酚計應不低于4 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取山奈酚對照品適量，加甲醇制成每1 ml含0.441 1 mg的對照品溶液，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密移取“2.1”項下提取液10 ml，置于100 ml具塞錐形瓶中，加入10 ml甲醇和1 ml 25%鹽酸，于90 ℃水浴中受熱水解1 h，取出迅速冷卻，轉移至25 ml量瓶中，用甲醇定容，搖勻，濾過，濾液再用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.4 標準曲線的制備 精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μl，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以進樣量（x，μg）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標（y），進行線性回歸，得回歸方程為y＝14 000 000x+6 012.2（r＝0.999 8）。結果表明，山奈酚進樣量在0.088 22～0.882 2 μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.3 單因素試驗優選鹽酸加入量

由于山奈酚主要與糖結合成苷而存在，所以需要用酸去水解而得到需要測定的山奈酚苷。筆者參考文獻[9-15]，在90 ℃下，分別加入0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 25%鹽酸，測定山奈酚含量，選擇最優加入量。結果表明，加入1.0 ml 25%鹽酸水解后測定的山奈酚含量最高。25%鹽酸加入量對山奈酚含量的影響見表1。

表1 25%鹽酸加入量對山奈酚含量的影響Tab 1 Effect of adding amount of 25%hydrochloric acid on content of kaempferol

2.4 正交試驗優選水提取工藝

以加水量（A）、提取時間（B）、提取次數（C）為考察因素，每個因素各選3個水平，以山奈酚含量為評價指標，采用L9（34）正交試驗表安排試驗。因素水平見表2；正交試驗結果見表3；方差分析結果見表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗結果Tab 3 Results of orthogonal test

由表3、表4可知，C因素即提取次數是主要影響因素，3個因素影響強弱順序為C＞B＞A，即提取次數＞提取時間＞加水量；優選出的條件為A2B3C3，即12倍量水煎煮3次，每次2 h。

表4 方差分析結果Tab 4 Results of analysis of variance

2.5 工藝驗證試驗

稱取槐角藥材150 g，共3份，按照最優工藝參數進行驗證試驗，測定山奈酚含量。結果，每1 g槐角藥材中含山奈酚分別為19.07、19.16、18.99 mg，RSD＝0.45%。3次驗證試驗結果表明，優選出來的提取工藝穩定、重現性好，能適合于大工業生產。

3 討論

槐角中山奈酚大多與糖結合成苷（如山奈酚-3-鼠李糖雙葡萄糖苷、山奈酚-3，7-雙葡萄糖苷）而存在，本試驗采用酸水解后，測定指標中的山奈酚含量為游離山奈酚及其苷水解后的山奈酚的總和。25%鹽酸加入量過多，也會對色譜柱有污染，因此應先用單因素優選出鹽酸用量。

由于山奈酚具有親脂性，易溶于熱乙醇、乙醚，微溶于水，在預試驗中還考察了在相同條件下水提取、60%乙醇提取和95%乙醇提取的效果。結果表明，60%乙醇提取的山奈酚含量略高于水提取工藝，考慮到大生產的成本，選擇水提取更經濟、實用。

本試驗用超高液相色譜儀測定山奈酚含量，分析時間短、重復性好、準確簡便，可在幾分鐘內完成分析，大大節約了分析時間，提高了檢測效率。

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