RP-HPLC法同時測定鹿蹄草中齊墩果酸和熊果酸的含量Δ

鄔浩杰，鄒盛勤（1.奉化市中醫(yī)院，浙江 奉化 315500；.宜春學院化學與生物工程學院，江西 宜春

336000）

鹿蹄草為鹿蹄草科植物Pyrola callianthaH.Andres或普通鹿蹄草P.decorataH.Andres的干燥全草，又名鹿銜草、破血丹等，具有祛風濕、強筋骨、止血、止咳等功效，臨床上一般用于治療風濕痹痛、腎虛腰痛、腰膝無力、月經(jīng)量過多、久勞咳嗽[1]等。現(xiàn)代藥理學研究表明，鹿蹄草具有明顯的抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降糖、降脂、保護心腦血管等作用[2]。鹿蹄草主要含有醌類、酚類、黃酮類、三萜類等化學成分[3-4]，其中三萜類成分主要為齊墩果酸和熊果酸，兩者互為同分異構體，通常以游離或結合為苷的形式廣泛存在植物界[5]。齊墩果酸和熊果酸均具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗炎、抗菌、保肝等功效[6-8]。目前，關于鹿蹄草化學成分的研究報道較多，但同時測定鹿蹄草中齊墩果酸和熊果酸含量的方法則鮮有報道。2010年版《中國藥典》（一部）收載的鹿蹄草含量測定項下僅以水晶蘭苷的含量為測定指標，而無其主要活性成分三萜酸類的含量測定標準[1]。為此，筆者建立了反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時測定鹿蹄草中齊墩果酸和熊果酸含量的方法，旨在為鹿蹄草的質(zhì)量控制和進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HPLC儀，包括515雙泵、2996型光電二極管陣列檢測器和Empower中文色譜數(shù)據(jù)工作站（美國Waters公司）；RO-MB-10D型高純水機（杭州永潔達膜分離設備廠）；CP225D型電子分析天平（德國Sartourius公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海恒科技儀器有限公司）；FY177型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；SK2510HP型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：59kHz）。

1.2 藥材

鹿蹄草購自安徽、云南和江西，經(jīng)宜春學院陳武教授鑒定為鹿蹄草科植物P.herba的全草。

1.3 試劑

齊墩果酸和熊果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110742-200314、110709-200304）；甲醇為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）；乙醇為分析純（江西洪都生物化學有限公司）；磷酸為分析純（上海化學試劑有限公司一廠）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（88 ∶12 ∶0.15，V/V/V）；流速：0.9 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μl。以齊墩果酸和熊果酸計，理論板數(shù)均大于10 000；分離度＞1.9；對稱因子分別為1.03和0.99。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.鹿蹄草；1.齊墩果酸；2.熊果酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.P.calliantha；1.oleanolic acid；2.ursolic acid

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取齊墩果酸和熊果酸對照品2.31、5.32 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含每1 ml含齊墩果酸0.231 mg和熊果酸0.532 mg的對照品混合溶液。

2.2.2 供試品溶液 取鹿蹄草樣品適量，置恒溫干燥箱中于70 ℃下干燥6 h，用高速粉碎機粉碎，分別精密稱取鹿蹄草樣品粉末各約3 g（安徽：3.094 0 g，云南：3.095 4 g，江西宜春：3.095 1 g，江西樟樹：3.069 4 g），分別置100 ml具塞錐形瓶中，加95%乙醇50 ml，稱定質(zhì)量，超聲提取1 h，冷卻，再次稱定，用95%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 線性關系考察

用微量注射器分別精密吸取齊墩果酸和熊果酸對照品混合溶液2.0、6.0、10.0、15.0、20.0 μl，按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積，采用外標法進行定量分析。以對照品的進樣量（x，μl）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得齊墩果酸的回歸方程為y＝5.32×105x－1.06×104（r＝0.999 98），熊果酸的回歸方程為y＝5.04×105x－9.07×103（r＝0.999 99）。結果表明，齊墩果酸和熊果酸進樣量在0.462～4.60 μg、1.064～10.640 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗

分別精密吸取對照品混合溶液10 μl，按上述色譜條件平行進樣5次，記錄色譜圖。結果，齊墩果酸和熊果酸峰的RSD分別為0.9%和0.7%（n均為5），表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗

取同一鹿蹄草樣品（安徽）6份，每份各約3.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，采用外標法計算樣品含量。結果，齊墩果酸和熊果酸含量的RSD分別為1.2%和0.9%（n均為6），表明該方法的重復性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品（江西宜春）溶液，分別于0、2、4、8、12、16、20 h按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，齊墩果酸和熊果酸的RSD分別為1.3%和0.7%（n均為7），表明供試品溶液至少在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一鹿蹄草樣品（江西宜春）適量，共9份，每份各約1.5 g，按高、中、低質(zhì)量濃度分別加入齊墩果酸和熊果酸對照品適量，再按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖，重復3次，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.8 樣品含量測定

精密吸取4批鹿蹄草樣品（安徽、云南、江西宜春和江西樟樹）制備的供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，每批平行測定3份，記錄峰面積，計算樣品含量。結果，4批樣品中齊墩果酸的質(zhì)量分數(shù)分別為0.122 0%、0.098 1%、0.130 3%、0.132 7%（n＝3），熊果酸的質(zhì)量分數(shù)分別為0.566 3%、0.425 7%、0.598 1%、0.6062%（n＝3）。

3 討論

由本試驗結果可知，不同產(chǎn)地的鹿蹄草中兩種三萜酸的含量存在一定差異，其中江西樟樹產(chǎn)樣品中齊墩果酸和熊果酸的質(zhì)量分數(shù)最高，分別為0.132 7%和0.606 2%；云南產(chǎn)樣品的質(zhì)量分數(shù)最低，分別為0.098 1%和0.425 7%。

齊墩果酸和熊果酸均屬于五環(huán)三萜類化合物，結構和極性相似，因此在色譜柱上的保留時間相近而難以完全分離。本試驗采用RP-HPLC法，以甲醇-水-磷酸（88 ∶12 ∶0.15，V/V/V）為流動相，同時測定了鹿蹄草中的兩種三萜酸類成分齊墩果酸和熊果酸，柱效高，分離度均＞1.9，且峰形對稱，可以有效地將兩者分開。

綜上所述，本方法簡單、準確，精密度和重復性良好，可為鹿蹄草藥材的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

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[4]石娟，王軍憲.鹿銜草化學成分的再研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2002，14（1）：37.

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