不同指標評價布渣葉藥材質量的聚類分析Δ

李澤華，徐文杰，董玉娟，汪夢霞，許燦新（1.廣東省人民醫院/廣東省醫學科學院，廣州 510080；2.廣東省中醫藥工程技術研究院，廣州 510095；.廣州中醫藥大學附屬第二中醫院，廣州 510405）

布渣葉為椴樹科植物破布葉Microcos paniculataL.的干燥葉，主產于我國嶺南地區，屬于廣東道地藥材。其味微酸、性平，具有消食化滯、清熱利濕的功效，臨床多用于飲食積滯、感冒發熱、濕熱黃疸等癥，已收載于2010年版《中國藥典》（一部）和《廣東省中藥材標準》（第一冊）[1-2]。布渣葉含有黃酮類、生物堿、三萜類、揮發油類等成分[3]，其中黃酮類是其主要活性成分[4]。關于不同產地的布渣葉中總黃酮及牡荊苷質量分數的分析已有相關報道[5-10]，但未見應用聚類分析法從總黃酮及牡荊苷質量分數兩個指標來對不同產地布渣葉進行質量評價的研究報道。筆者選擇不同產地的布渣葉，分別以總黃酮與牡荊苷的含量為指標，并應用聚類分析法對布渣葉進行產區分類，以為完善布渣葉的藥材質量評價標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；2695-2998型高效液相色譜（HPLC）儀，配備PAD檢測器、四元梯度泵、Empower 2數據處理系統（美國沃特斯公司）；KQ5200DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mettler XS205DU型電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；MilliPore Advantage A10自動純水機（美國默克密理博公司）。

1.2 試劑

蘆丁對照品（批號：100080-200707）、牡荊苷對照品（批號：111687-200602）均購于中國食品藥品檢定研究院；D101型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

布渣葉經廣東省中醫藥工程技術研究院劉法錦教授鑒定為椴樹科植物破布葉M.paniculataL.的干燥葉，藥材來源見表1。

表1 布渣葉藥材來源Tab 1 Source ofM.paniculata

2 方法與結果

2.1 牡荊苷的含量測定[1]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：AKKZONOBEL Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%甲酸溶液（30 ∶70，V/V）；檢測波長：339 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃。色譜見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 取牡荊苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 ml含牡荊苷106.70μg的對照品溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取布渣葉藥材粉末（過3號篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，稱定質量，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理1 h，放冷，再次精密稱定，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

圖1 高效液相色譜圖A.樣品；B.對照品；1.牡荊苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.sample；B.control substance；1.vitexin

2.1.4 線性關系考察 精密量取“2.1.2”項下的對照品溶液1、2、6、9、12、15 ml，分別置25 ml量瓶中，加入70%甲醇稀釋至刻度，制成每1 ml含牡荊苷4.27、8.54、25.62、38.43、51.24、64.05μg的對照品溶液。精密吸取上述溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積積分值（y）為縱坐標，進樣量（x，ng）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝2 338.3x+8 595（r＝0.999 9）。結果表明，牡荊苷的進樣量在42.70～640.50 ng范圍內與其峰面積積分值呈良好線性關系。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取牡荊苷對照品溶液（質量濃度為106.70 μg/ml）10 μl，按上述色譜條件進樣測定，重復5次，記錄色譜圖。結果，RSD＝1.02%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 取同一供試品（S1）溶液，分別于0、1、2、4、6、8、10 h按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，RSD＝1.35%（n＝7），表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（S1）6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算樣品含量。結果，牡荊苷的平均質量分數為0.11%，RSD＝1.16%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知質量分數的樣品（S1）約1.0 g，共9份，精密稱定，分別精密加入適量的牡荊苷對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算加樣回收率，結果見表2。

2.1.9 樣品中牡荊苷的含量測定 取布渣葉藥材適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算樣品中牡荊苷的質量分數，結果見表3。

2.2 總黃酮的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，加70%乙醇超聲（功率：250 W，頻率：100 kHz）使溶解，制成每1 ml含0.46 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取各批次布渣葉藥材粉末（過3號篩）約2.0 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 ml，稱定質量，超聲（功率：250 W，頻率：100 kHz）處理30 min，放冷，再次精密稱定，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 ml，95 ℃水浴加熱，蒸干，加水5 ml使溶解，過D101型大孔吸附樹脂柱，以水100 ml洗脫，棄去水液，再用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，置50 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。

表2 牡荊苷加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

表3 樣品中牡荊苷的含量測定結果（n＝2）Tab 3 Content determination of vitexin in samples（n＝2）

2.2.3 線性關系考察 精密量取對照品溶液1、2、3、4、5、6 ml，分別置25 ml量瓶中，加70%乙醇至6 ml，依次精密加入5%亞硝酸鈉溶液1 ml（搖勻，放置6 min）、10%硝酸鋁溶液1 ml（搖勻，放置6 min）、氫氧化鈉試液10 ml，加水至刻度（搖勻，放置15 min），以相應試劑為空白，在500 nm波長處測定吸光度（A）。以A（y）為縱坐標，質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.008 8x+0.064 2（r＝0.999 5）。結果表明，蘆丁的質量濃度在18.28～109.68 μg/ml范圍內與其吸光度呈良好線性關系。

2.2.4 樣品中總黃酮的含量測定 取上述布渣葉藥材，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定吸光度，結果見表4。

表4 樣品中總黃酮的含量測定結果（n＝2）Tab 4 Content determination of total flavonoids in samples（n＝2）

2.3 聚類分析

應用SAS JMP Statistical Discovery V9.0.2.0統計分析大師軟件，采用離差平方和法，選取歐氏距離平方和作為樣品的測度，對20份布渣葉樣品的牡荊苷和總黃酮的質量分數分別進行聚類分析。樣品中牡荊苷、總黃酮含量的聚類分析樹狀圖見圖2；樣品中牡荊苷、總黃酮含量的聚類歷史記錄見表5、表6。

圖2 樣品中牡荊苷、總黃酮含量的聚類分析樹狀圖A.牡荊苷含量；B.總黃酮含量Fig 2 Cluster analvsts of the content of vitexin and total flavonoids in samplesA.vitexin；B.total flavonoids

以牡荊苷的質量分數為指標，當歐氏距離為0.75時，所有樣品分為四大類，其中1、11、12聚為一類，3、5、13、14、16、19聚為一類，7、10、17、18聚為一類，2、4、6、8、9、15、20聚為一類。以總黃酮的質量分數為指標，當歐氏距離為0.72時，所有樣品分為四大類，其中1、5、15、16、17、20聚為一類，2、6、9、10、18聚為一類，11為一類，3、4、7、8、12、13、14、19聚為一類。結果表明，同一產區的布渣葉并沒有全部歸為一類，這可能與布渣葉藥材具體的采收地點、采收時間、干燥方法、貯藏方法不同等有關，也說明布渣葉對地理環境、采收時間和加工貯藏方法等因素比較敏感。

采用SPSS Statistic 17.0統計軟件對布渣葉中牡荊苷與總黃酮質量分數的相關性進行分析。結果表明，二者沒有顯著性關系，相關性數據見表7。

表5 樣品中牡荊苷含量的聚類歷史記錄Tab 5 Cluster record of the content of vitexin in samples

表6 樣品中總黃酮含量的聚類歷史記錄Tab 6 Cluster record of the content of total flavonoids in samples

3 討論

在總黃酮質量分數測定中，筆者分別以供試品、對照品及空白對照在200～800 nm波長范圍內進行掃描。結果顯示，對照品溶液及供試品溶液的最大吸收波長一致，兩者在（500±2）nm處有最大吸收，故選擇500 nm為測定波長。

本研究分別以牡荊苷和總黃酮的質量分數為指標進行聚類分析，二者結果不相同，進一步對樣品中牡荊苷和總黃酮質量分數的相關性進行研究，二者仍無相關性，即牡荊苷質量分數的高低并不能代表樣品中總黃酮的高低，這同時也表明，以單一活性成分判斷藥材質量的優劣是有缺陷的。本研究結果表明布渣葉藥材的質量受到諸多因素的影響，且評價布渣葉藥材質量時應進行多指標的綜合評價。

表7 樣品中牡荊苷與總黃酮含量的相關性分析Tab 7 Relative data of the contents of vitexin and total flavonoids in samples

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：88-89.

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