HPLC法同時測定鐵包金不同藥用部位中蘆丁和槲皮素的含量

王吉文，房志堅，成金樂，嚴寒靜（.廣東藥學院中藥學院，廣州 50006；.中山市中智藥業集團有限公司，廣東中山 58437）

鐵包金（Berchemia lineata）為鼠李科勾兒茶屬常用的一味民族藥，其主要來源包括細葉勾兒茶、光枝勾兒茶、多花勾兒茶、多葉勾兒茶的藤莖或根，具有消腫解毒、止血鎮痛、祛風除濕之功效，主治癰疽疔毒、咳嗽咯血、消化道出血、跌打損傷、燙傷、風濕骨痛、風火牙痛等癥[1-4]。據文獻報道，鐵包金中含有黃酮類、萜類、木脂素類等多種化學成分，其中黃酮類化合物蘆丁和槲皮素為其主要成分[5]，其對S180實體瘤有較好的抑制作用，且無順鉑的毒副作用[6-7]。為提高鐵包金的質量控制標準，本試驗采用高效液相色譜（HPLC）法對鐵包金根、莖、葉中的蘆丁和槲皮素的含量進行測定。

1 材料

1.1 儀器

600型HPLC儀，包括2487型紫外檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；CP225D型電子天平（德國Sartorius公司）；KQ-500型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀有限公司）。

1.2 試劑

蘆丁對照品（批號：100080-200707）、槲皮素對照品（批號：100081-200907）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

1.3 藥材

鐵包金藥材經廣東藥學院房志堅副教授鑒定，分別為鼠李科勾兒茶屬植物細葉勾兒茶[Berchemia lineata（L.）DC.]、光枝勾兒茶（Berchemia polyphyllaWall）、多花勾兒茶[Berchemia floribunda（Wall.）Brongn.]，具體來源見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：迪馬ODS C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-甲醇（5 ∶1.5，V/V，A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，25%A；5～40 min，25%→60%A）；流速：0.9 ml/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μl。在此色譜條件下，理論板數按槲皮素計不低于3 000；分離度均＞1.5。色譜見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取蘆丁和槲皮素對照品各3.76、4.62 mg，分別置10 ml量瓶中，加甲醇定容，即得蘆丁和槲皮素對照品貯備液。分別吸取上述對照品貯備液5.0、0.5 ml，置同一25 ml量瓶中，加甲醇定容，即得每1 ml含蘆丁75.20 μg、槲皮素9.24 μg的混合對照品溶液。另吸取上述蘆丁對照品貯備液0.4 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇定容，即得每1 ml含蘆丁6.02 μg的蘆丁對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取鐵包金根、藤莖、葉的干燥粉末（過2號篩）各2.0、1.0、0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入40、20、10 ml 80%乙醇，回流提取2 h，放冷，濾過，揮干，殘渣加甲醇使溶解，將根、藤莖、葉提取物分別轉移至10、10、25 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液1、5、10、15、20、25 μl，蘆丁對照品溶液2 μl，按上述色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。以進樣量（x，μg）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得蘆丁和槲皮素的回歸方程分別為y＝1 063 575.51x+10 240.90（r＝0.999 8）、y＝3 012 505.50x－5 201.14（r＝0.999 8）。結果表明，蘆丁和槲皮素的進樣量分別在0.01～1.88、0.01～0.23 μg范圍內與各自峰面積積分值呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗

精密吸取含蘆丁157.80 μg/ml、槲皮素11.30 μg/ml的混合對照品溶液10 μl，按上述色譜條件進樣測定，重復6次，記錄色譜圖。結果，蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.82%、1.63%（n＝6），表明所用儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗

取細葉勾兒茶（廣東中山）葉的干燥粉末（過2號篩）共6份，每份約0.1 g，精密稱定，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為1.79%、1.78%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.6 穩定性試驗

精密吸取細葉勾兒茶（廣東中山）葉制成的供試品溶液10 μl，分別于0、2、4、6、8、12 h按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.34%、1.70%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量的細葉勾兒茶（廣東中山）葉的干燥粉末（過2號篩）共6份，每份約50 mg，精密稱定，分別精密加入蘆丁、槲皮素對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算加樣回收率，結果見表2。

2.8 樣品含量測定

取不同產地的鐵包金樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算樣品含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n＝2）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝2）

3 討論

3.1 提取方法的選擇

預試驗中，筆者對比了不同提取溶劑（水、甲醇、乙醇）和提取方法（超聲、回流），結果提取效率為回流＞超聲，乙醇＞甲醇＞水；進一步對乙醇的體積分數、提取時間進行考察，結果采用80%乙醇回流提取2 h的提取效率最高。

3.2 流動相的選擇

流動相考察了甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-磷酸、乙腈-甲醇-磷酸等溶液不同比例的等度與梯度洗脫。結果顯示，流動相為乙腈-甲醇（5 ∶1.5，V/V，A）-0.2%磷酸（B）梯度洗脫時，色譜圖的基線平穩，蘆丁、槲皮素峰形對稱，能與其他組分達到基線分離。

3.3 檢測波長的選擇

本研究對不同吸收波長（250、260、285、360、370 nm）下的圖譜進行了分析。結果表明，在360 nm波長下，蘆丁、槲皮素與雜質峰能較好分離，且吸光度較高。

3.4 蘆丁對照品溶液的制備

由于鐵包含不同部位樣品中蘆丁含量差距較大，為了保證所有樣品中蘆丁含量均在標準曲線范圍內，故本研究另制備另一低濃度的蘆丁單獨進樣擴大蘆丁的標準曲線范圍。

已有相關文獻[8-9]對鐵包金中槲皮素的含量進行了測定，但并未明確指出所用藥材各部位的含量。本試驗結果表明，鐵包金藥材中的蘆丁、槲皮素主要集中在葉和藤莖部位，根中的含量較低，其中多花勾兒茶根、藤莖部位不含蘆丁，可利用其特點與其他兩種植物區別開來；葉的槲皮素含量高于藤莖，這與張榮祥等[9]的結論一致；6批不同產地的細葉勾兒茶樣品中，廣東廣州產的根、藤莖、葉中的蘆丁含量最高，廣東清遠產的藤莖部位的槲皮素含量高于其他產地；不同品種葉的部位中，細葉勾兒茶蘆丁、槲皮素的含量最高，其次為光枝勾兒茶、多花勾兒茶。

[1]江蘇新醫學院.中藥大辭典[M].上海：上海科學技術出版社，2000：2 607-2 608.

[2]滕紅麗，陳科力，陳士林.壯藥鐵包金及其藥材商品的物種基礎[J].中藥材，2010，33（5）：674.

[3]藏志和，曹麗萍，鐘鈴.蘆丁藥理作用及制劑的研究進展[J].醫藥導報，2007，26（7）：758.

[4]孟德勝，汪士良.槲皮素及其苷類研究進展[J].中國藥房，2000，11（5）：232.

[5]張國利，滕紅麗，陳科力.壯藥鐵包金的化學成分及藥理作用研究進展[J].中國醫藥導報，2011，8（6）：5.

[6]陳小龍，滕紅麗，沈玉霞，等.鐵包金總黃酮體內對S180實體瘤的抑制作用[J].中國藥理學報，2011，27（1）：121.

[7]廣西壯族自治區衛生廳.廣西中藥材標準[M].南寧：廣西科學技術出版社，1990：260-261.

[8]郭力城，滕紅麗，梅之南.鐵包金藥材中槲皮素的薄層鑒別與含量測定研究[J].時珍國醫國藥，2012，23（12）：2 983.

[9]張榮祥，阮婧華，王道平.反相高效液相色譜法測定鐵包金中槲皮素的含量[J].貴州教育學院學報：自然科學版，2011，20（12）：4.