HPLC法測(cè)定骨癰內(nèi)消丸中綠原酸的含量

楊 斌（宜賓市第二人民醫(yī)院，四川宜賓 644000）

骨癰內(nèi)消丸系四川省宜賓縣骨科醫(yī)院根據(jù)傳統(tǒng)驗(yàn)方研制的中藥丸劑，由防風(fēng)、當(dāng)歸、紫花地丁、蒲公英、金銀花等20味中藥組成，具有清熱解毒、消腫潰堅(jiān)、活血止痛的功效，臨床主要用于骨髓炎初期、開放性骨折感染、痛腫瘡瘍或軟組織損傷感染等。方中金銀花、蒲公英、紫花地丁等藥材均含有綠原酸，為該藥的有效成分之一[1-4]。綠原酸又名咖啡單寧酸，化學(xué)名為3-O-咖啡酰奎尼酸，是由咖啡酸與奎尼酸組成的羧酚酸，具有多種生物活性，如心血管保護(hù)、抗氧化、抗紫外及抗輻射、抗誘變、抗癌、抗菌、抗病毒、降脂降糖和免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6]。本試驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定骨癰內(nèi)消丸中總綠原酸的含量，以期為骨癰內(nèi)消丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；CP225D型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司，精度：0.01 mg）。

1.2 藥品與試劑

骨癰內(nèi)消丸（宜賓縣骨科醫(yī)院，批號(hào)：130215、131217、140321）；綠原酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-200413）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸溶液（8∶92，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。在此色譜條件下，理論板數(shù)按綠原峰計(jì)不低于5 000；分離度＞1.5。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.綠原酸對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.綠原酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.chlorogenic acid control；B.test sample；C.negative control；1.chlorogenic acid

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取綠原酸對(duì)照品8.78 mg，置50 ml量瓶中，加50%甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為0.175 6 mg/ml的對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液5 ml，置25 ml量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取骨癰內(nèi)消丸粉末1 000 mg，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 ml，稱定質(zhì)量，85 ℃水浴回流0.5 h，放冷，再次精密稱定，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按骨癰內(nèi)消丸的處方和制劑工藝，制備不含金銀花、蒲公英、紫花地丁、當(dāng)歸、梔子、黃連、菌花、防風(fēng)等8味藥材的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得綠原酸的回歸方程為y＝3.107×103x－6.913（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，綠原酸的進(jìn)樣量在0.035 1～0.702 4 μg范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)6次，記錄色譜圖。結(jié)果，RSD＝0.3%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：130215）制成的供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)5次，記錄色譜圖。結(jié)果，RSD＝1.8%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：130215）1 000 mg，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，RSD＝1.2%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品500 mg，共9份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入低、中、高濃度的對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.8 樣品含量測(cè)定

取3批骨癰內(nèi)消丸粉末各1 000 mg，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批制備3份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算樣品中綠原酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

本試驗(yàn)分別采用了甲醇[7]、50%甲醇[8-9]、乙醇、50%乙醇[9]作為提取溶劑，結(jié)果50%甲醇提取的綠原酸含量較高，因此選擇50%甲醇作提取溶劑。本試驗(yàn)還對(duì)提取方法（超聲30 min、回流1 h）進(jìn)行了考察，結(jié)果回流1 h測(cè)得的綠原酸含量較高。本試驗(yàn)還考察了回流時(shí)間（15、30、45、60、90 min），結(jié)果顯示不同回流時(shí)間所測(cè)得綠原酸含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為了確保綠原酸提取完全，本試驗(yàn)最終選擇了回流30 min。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便、迅速，精密度、重復(fù)性好，可用于骨癰內(nèi)消丸中綠原酸的含量測(cè)定。

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