生物共代謝法降解石油污染土壤中的萘、菲*

生物共代謝法降解石油污染土壤中的萘、菲*

楊智臨 陳海 白智勇 李博 楊琦

中國地質大學（北京）水資源與環境學院

利用從石油污染土壤中篩選分離出的專一性降解萘菌株Rhodococcus（紅球菌屬）與菲菌株Nocardioides（類諾卡氏菌屬）對萘、菲進行共代謝降解研究。以菲為共代謝基質萘降解菌降解萘的最佳菲初始投加量為0.064mg/L，最佳溫度為35℃；以萘為共代謝基質菲降解菌降解菲的最佳萘初始投加量為7.16mg/L，最佳降解溫度為25℃。在本實驗范圍內以菲為共代謝基質萘降解菌降解萘的最高去除率達到86%；以萘為共代謝基質菲降解菌降解菲的最高去除率為42%。

共代謝；萘；菲；實驗；降解

隨著工業的發展，萘、菲造成的環境污染問題也越發明顯，其中，萘在油田污水中廣泛存在，是油田污水的特征污染物之一，某油田石油污水中曾檢出多達數十種萘及萘系化合物。菲比萘有更強的毒性，近年來在環境和生物體內的檢出率非常高。利用從石油污染土壤中篩選分離出的專一性降解萘菌株Rhodococcus（紅球菌屬）與菲菌株Nocardioides（類諾卡氏菌屬）對萘、菲進行共代謝降解研究。

1 實驗材料與方法

1.1 試驗試劑與儀器

儀器：立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，潔凈工作臺，恒溫水浴振蕩器，分光光度計，高速冷凍離心機，液相色譜儀等。

材料試劑：萘、菲（J&KCHEMICA）、牛肉膏、蛋白胨等。

1.2 萘、菲的檢測方法

萘、菲濃度以高效液相色譜測定，色譜柱為C—18反相色譜柱，λ=254nm，流動相為甲醇∶水=90∶10，流速為1.0mL/min，進樣量為20μL。

1.3 萘、菲降解菌的富集培養

將從石油污染土壤中篩選出的萘（菲）降解菌接種于滅菌后的無機鹽培養液中，添加一定量的固體萘（菲）作為唯一碳源，接種后將錐形瓶放入溫度為30℃的恒溫振蕩器中進行培養。

1.4 萘、菲互為共代謝基質的降解實驗

降解實驗在250mL血清瓶中進行，取218mL滅菌后的無機鹽溶液倒入血清瓶中，并分別加入不同量的萘、菲，迅速將瓶塞塞上，用封口膜封住，搖勻，放入水浴振蕩器12h并混勻。

2 實驗結果與分析

2.1 以菲為共代謝基質降解萘菌對萘的降解

（1）不同濃度菲共代謝基質下降解萘菌對同一濃度萘的降解。初始條件：萘的初始濃度為7mg/L，溫度為30℃，初始值pH值為7，菌懸液接種量為1%，轉速為150r/min。從不同菲基質濃度下萘降解菌對同一濃度萘的降解曲線可看出，在0.064mg/L時，菌種對萘的去除效果最好，去除率為67%；而在濃度為0.1～0.6mg/L之間菌種對萘的去除略差，對萘的去除率約為60%，從總體上來講，菲的加入抑制了菌種對萘的降解。

（2）以菲為共代謝基質在不同溫度條件下降解萘菌對同一濃度萘的降解。初始條件：萘的初始濃度為7mg/L，pH值為7，菲的初始濃度為0.1mg/L，菌懸液接種量為1%，轉速為150r/min。從以菲為共代謝基質、在不同溫度條件下降解萘菌對同一濃度萘的降解曲線可看出，隨溫度的升高，菌種對萘的降解效果逐漸明顯，說明在一定的范圍內，溫度的升高對細菌體內酶的活性有提高作用，加快了降解萘的反應過程；在35℃時降解效果最好，去除率為61%。

2.2 以萘為共代謝基質降解菲菌對菲的降解

（1）不同濃度萘共代謝基質下降解菲菌對同一濃度菲的降解。初始條件：菲的初始濃度為0.55mg/L，溫度為30℃，初始pH值為7，菌懸液接種量為1%，轉速為150r/min。從不同萘基質濃度下降解菲菌對同一濃度菲的降解曲線可看出，隨著萘的濃度升高，菌種對菲的降解程度呈現變大趨勢，這說明萘的加入對菌種降解菲有一定的促進作用；在萘的濃度為7.16mg/L時，菌種對菲的降解達到了最大值，去除率為43%。

（2）以萘為共代謝基質在不同溫度條件下降解菲菌對同一濃度菲的降解。初始條件：菲的初始濃度為0.55mg/L，pH值為7，萘的初始濃度為7mg/L，菌懸液接種量為1%，轉速為150r/min。從以萘為共代謝基質、在不同溫度條件下降解菲菌對同一濃度菲的降解曲線可看出，在30℃時菌種對菲的降解效果最差，對菲去除率為22%；而在35℃時，降解效果最好，對菲的去除率為42%。

3 菌種的生長曲線分析

準備兩個錐形瓶，向錐形瓶內分別接種1%的萘降解菌株和菲降解菌株，然后萘、菲混合后分別向兩個錐形瓶中投加足夠量以提供碳源，在30℃、150r/min搖床上培養，定時對菌株的生長進行檢測，利用OD600來表征菌量的多少。

從萘、菲共同作為碳源降解萘菌、菲菌的生長曲線可以看出，兩株菌的生長均有明顯的對數增殖期（減速增殖期）、穩定期、內源呼吸期；另外，與單獨碳源相比，此時的細菌生長開始的適應期較明顯，說明在萘、菲兩種碳源加入后，細菌對培養基的適應需要一段時間；與菲菌的生長不同的是，萘菌生長的增殖期兩段比較明顯，前10天細菌生長速度比較快，后10天細菌也在生長，但生長速率比前10天略??；基本上在40天的時候，兩株菌的菌量都在減少，到60天時趨于穩定。

4 結論

（1）以菲為共代謝基質萘降解菌降解萘的最佳菲初始投加量為0.064mg/L，最佳溫度為35℃；以萘為共代謝基質菲降解菌降解菲的最佳萘初始投加量為7.16mg/L，最佳降解溫度為25℃。

（2）在本實驗范圍內以菲為共代謝基質萘降解菌降解萘的最高去除率達到86%；以萘為共代謝基質菲降解菌降解菲的最高去除率為42%。

（3）在萘、菲互相共代謝條件下兩種菌株的生長都有明顯的對數增殖期（減速增殖期）、穩定期、內源呼吸期，與單獨碳源條件下相比，此時細菌生長的適應期明顯。

（欄目主持 楊軍）

10.3969/j.issn.1006-6896.2014.11.024

基金論文：重點防控重金屬汞、鉻、鉛、鎘、砷便攜/車載/在線監測儀器開發與應用示范（2012YQ060115）；中央高校基本科研業務費專項資金資助（2652013101，2652013086，2652013087）。