多效生長因子（PTN）mRNA及其蛋白在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

董子龍武妍婷張生彬

多效生長因子（PTN）mRNA及其蛋白在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

董子龍①武妍婷①張生彬①

目的：探討結直腸癌組織中多效生長因子（PTN）mRNA及其蛋白的表達情況及臨床意義。方法：購買結直腸癌組織芯片標本90例（實驗組），正常結直腸組織芯片70例（對照組），采用原位雜交和免疫組化染色方法，檢測兩組PTN mRNA及其蛋白的表達；另選擇2009年11月-2013年12月手術治療的原發結直腸癌患者90例，分析PTN mRNA及其蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系。結果：實驗組PTN mRNA陽性表達率為62.2%，PTN蛋白陽性表達率為58.9%，與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同年齡、性別及不同腫瘤類型之間，PTN mRNA及其蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；不同TNM分期和不同分化程度，PTN mRNA及其蛋白陽性表達差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論：PTN mRNA及其蛋白與腫瘤分期和分化程度有密切關系，可作為判斷結直腸癌預后的參考依據。

多效生長因子； PTN蛋白； 結直腸癌組織

結直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，具有較高的死亡率，我國作為結直腸癌的高發國家，其發病率呈顯著上升趨勢[1-2]。PTN作為重要的生長因子，具有多信號功能，能夠促進神經系統發育、血管發生及刺激細胞增殖和遷移[3-4]。本文回顧性分析PTN在結直腸癌組織中的表達情況，旨在為判斷預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 購買由陜西超英生物科技有限公司生產的結直腸癌組織芯片標本共90例（實驗組），正常結直腸組織芯片70例（對照組）。另選擇2009年11月-2013年2月手術治療的原發性結直腸癌患者90例，男52例，女38例；年齡20～75歲，中位年齡53歲；其中＜55歲共43例，≥55歲共47例；直腸癌37例，結腸癌53例；腫瘤TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期48例，Ⅲ期24例，Ⅳ期6例；分化程度：高分化63例，中低分化27例。所有標本均經組織病理學檢查證實為結直腸癌。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗儀器 SantaCruz公司生產的人重組PTN細胞因子、PTN 單克隆抗體以及PTN多克隆抗體；西安沃爾森生物科技有限公司生產的原位雜交試劑盒、堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、免疫組化試劑盒及無水乙醇；上海生工生物工程有限公司制造的PTN探針；浙江臨安電子器材廠制造的YWY781型醫用微波儀；德國Leica光學顯微鏡。

1.2.2 PTN mRNA檢測 原位雜交法：（1）二甲苯脫蠟處理石蠟切片，1 g/L蛋白酶K作用15 min；雙蒸水洗1 min后用無水乙醇洗2 min，吹干。（2）預雜交：預雜交液（50 μL）滴加在切片上，置于42 ℃恒溫箱孵育30 min，去除預雜交液。（3）雜交：雜交液（20 μL）滴加在切片上，硅化蓋玻片蓋好后放置在37 ℃濕暗盒中24 h。（4）免疫檢測：0.5 mL Buffer1清洗2 min后，滴加30 μL濃度為0.1 mol/L中性鹽溶液和10%聚乙二醇辛基苯基醚，再滴加1.0 mL Buffer1，室溫孵育30 min，滴加15 μL濃度為0.1 mol/L的NSS和45μL 10% TritonX-100，滴加Buffer1到1.5 mL，同時滴加50 μL抗地高辛抗體，室溫下孵育2 h；Buffer1清洗2次后Buffer3清洗，光學顯微鏡下，在暗盒內監控顯色反應程度，細胞漿染色與細胞外背景表現為明顯差異時用Buffer4終止反應；（5）核固紅襯染5 min，脫水后以中性樹膠封片。PTN 探針序列：地高辛標記3′端，鎖核酸修飾中部“（T）”的堿基。陰性對照使用PBS替代雜交液。

1.2.3 PTN蛋白檢測 免疫組化染色法：參照文獻[5]采用微波-EliVision TM法進行操作。陽性對照為PTN蛋白陽性表達的直腸癌組織，陰性對照為PBS代替一抗。

1.3 評價標準 參照文獻[5]對原位雜交及免疫組化染色結果進行評價。（1）PTN探針雜交陽性：細胞質和細胞核中發現淺藍色至深藍色顆粒。每張切片隨機選擇5個高倍視野進行測定平均陽性反應面積。陰性：陽性面積≤20%；陽性：陽性面積＞20%。（2）免疫組化染色陽性：細胞漿內發現淺棕至深棕色顆粒。隨機選取5個高倍視野，計算平均陽性染色細胞率。陰性：陽性染色細胞率＜5%；弱陽性：陽性染色細胞率5%～25%；陽性：陽性染色細胞率25%～50%；強陽性：陽性染色細胞率＞50%。（3）染色強度計分：不著色：1分，淡黃色：2分，淺棕色：3分，深棕色：4分。兩種計分相乘后，乘積值依次對應0、2、6及12分，0和2為陰性，6和12為陽性。

1.4 統計學處理 應用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料應用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTN mRNA及其蛋白表達結果 兩組組織芯片均能夠發現PTN mRNA表達（圖1、圖2）。PTN mRNA在正常結直腸組織中主要在黏膜上皮細胞表達，而結直腸癌組織中，主要在腫瘤細胞細胞質，呈彌漫性或灶性分布。PTN蛋白在正常結直腸組織中在正常腺體細胞的細胞漿進行表達（圖3）；而在結直腸癌組織中，不僅表達于結直腸癌細胞，在血管內皮細胞中也可表達（圖4）。

圖1 結直腸癌組織PTN mRNA表達

圖2 正常結直腸組織PTN mRNA表達

圖3 結直腸癌組織PTN蛋白表達

圖4 正常結直腸組織PTN蛋白表達

2.2 兩組PTN mRNA及其蛋白陽性表達率比較 實驗組PTN mRNA陽性表達率為62.2%，PTN蛋白陽性表達率為58.9%，對照組分別為41.4%、34.3%，兩組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 PTN mRNA及蛋白表達與臨床病理的關系 通過觀察結直腸癌組織中PTN mRNA及其蛋白的表達情況，結果表明，年齡、性別及腫瘤類型對PTN mRNA及其蛋白無顯著影響（P＞0.05）；而TNM分期、分化程度與PTN mRNA及其蛋白陽性表達率有顯著關系（P＜0.05），見表2。

表1 兩組PTN mRNA及其蛋白陽性表達率比較 例（%）

表2 PTN mRNA及蛋白表達與臨床病理的關系

3 討論

結直腸癌是臨床高發惡性腫瘤之一，目前手術治療是其主要的治療方法，但治療效果較差。TNM分期及腫瘤分化是臨床上預測結直腸癌預后的主要依據，也是進行放化療的主要參考指標。PTN基因主要分布在7q33～q34，其長度超過100 kb，由5個外顯子和1個非翻譯的外顯子組成，PTN編碼氨基酸的蛋白質共有168個，其中包含信號肽（32個氨基酸共同組成），PTN基因種屬不同呈現出高度保守的特點，PTN是已知的生長因子中最保守的基因之一[4，6]。研究發現，PTN與腫瘤的發生發展具有密切關系，能夠為腫瘤預后提供參考依據[7-9]。本實驗結果顯示，與正常結直腸組織相比較，結直腸癌組織的PTN mRNA陽性表達率和PTN蛋白陽性表達率顯著升高（P＜0.05）；TNM分期不同、分化程度不同，PTN mRNA及其蛋白陽性表達存在顯著性，即分期越晚，分化程度越高，PTN mRNA及其蛋白陽性表達率越高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。PTN是分泌性生長、分化因子，與肝素具有高度親和作用，能夠促進血管生成、改善神經系統及骨發育情況，增強細胞增殖與遷移，在腫瘤患者中，PTN能夠對V-sis原癌基因轉化細胞、子宮細胞DNA合成、內皮細胞和成纖維細胞有絲分裂起促進作用[9]。

目前有研究利用流式細胞術證實PTN顯性失活，神經膠質瘤細胞惡性表型能夠逆轉，細胞周期減慢，提示PTN對染色體分離及細胞周期具有重要調控作用。也有研究發現大腦室管膜下層處于發育中的神經膠質母細胞及室管膜細胞可檢測到PTN mRNA，提示PTN對大腦神經、血管具有重要作用[9-10]。

綜上所述，PTN與結直腸癌的惡化程度具有密切關系，監測結直腸癌患者PTN表達有利于正確判定結直腸癌患者預后。

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The Expression and Clinical Significance of Pleiotrophin （PTN） mRNA and Its Protein in Colorectal Carcinoma/

DONG Zi-long，WU Yan-ting，ZHANG Sheng-bin.//Medical Innovation of China，2014，11（08）：008-010

Objective：To discuss the expression and clinical significance of pleiotrophin （PTN） mRNA and its protein in colorectal carcinoma tissues.Method：90 cases of colorectal carcinoma（the exprimental group）and 70 cases of normal colorectal tissues（the control groups）were selected. The situ hybridization and immunohistochemical staining methods were used to detect PTN mRNA and protein expression in the two groups. 90 cases of primary colorectal carcinoma who under surgical treatment were selected，and the relationsnip of PTN mRNA and protein expression with chinical pathological characteristics of the colorectal cancer patients were analyzed.Result：In the experimental group， PTN mRNA positive expression rate was 62.2%， PTN protein positive expression rate was 58.9%， there was a statistically significant difference when compared with the control group （P＜0.05）. There were no significant differences in PTN mRNA and protein expression for different ages， genders and cancer types （P＞0.05）. There were significant differences in PTN mRNA and protein expression for different TNM staging and different degree of differentiation （P＜0.05）.Conclusion：PTN mRNA and protein is closely related to tumor stage and degree of differentiation， it can be used as the reference for judging prognosis ofcolorectal carcinoma.

Pleiotrophin； PTN protein； Colorectal carcinoma tissues

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.08.004

2014-01-16） （本文編輯：蔡元元）

①內蒙古醫科大學第三附屬醫院 內蒙古 包頭 014010

董子龍

First-author’s address： The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Baotou 014010，China