經肝動脈自體骨髓或臍帶血干細胞移植治療失代償期肝硬化患者的安全性和近期療效比較*

王方，云升皓，周新人，寇俊峰，蔡國芳，陳瑞麗，楊興坤，張靜，馮淑賢

·肝硬化·

經肝動脈自體骨髓或臍帶血干細胞移植治療失代償期肝硬化患者的安全性和近期療效比較*

王方，云升皓，周新人，寇俊峰，蔡國芳，陳瑞麗，楊興坤，張靜，馮淑賢

目的比較經肝動脈途徑注入自體骨髓干細胞或臍帶血干細胞治療失代償期肝硬化患者的安全性，以及對患者肝功能和凝血酶原活動度的近期改善作用。方法選擇失代償期肝硬化患者65例，隨機分為骨髓組33例和臍血組32例；骨髓組患者經股動脈插管至肝固有動脈注入自體骨髓干細胞移植治療，臍血組經同樣途徑注入臍帶血干細胞治療；治療后8周檢測血清谷丙轉氨酶、總膽紅素、凝血酶原活動度、白蛋白和甲胎蛋白水平變化，同時觀察臨床癥狀的改善情況及術后的不良反應。結果治療后第3天兩組患者乏力、納差癥狀均有改善，兩組間差異無顯著性。治療后8w，骨髓組和臍血組白蛋白水平分別由（31.0±4.6）g/L上升至（34.6±7.1）g/L和由（34.6±7.1）g/L上升至（37.8±8.3）g/L，凝血酶原活動度上升由（48.8±13.4）%上升至（55.5±11.2）%和由（47.5±12.5）上升至（58.9±14.0）%，但兩組間改善程度的差異無顯著性；在治療8w末血清谷丙轉氨酶、總膽紅素和甲胎蛋白在骨髓組分別為（45.6±12.3）IU/L、（28.1±13.5）μmol/L和（11.3±4.1）μg/L，在臍血組分別為（47.2±11.8）IU/L、（30.7± 14.8）μmol/L和（9.8±3.5）μg/L，兩組間與基礎水平相比改善程度的差異也無顯著性。結論自體骨髓干細胞或臍帶血干細胞經肝動脈途徑移植治療失代償期肝硬化患者的近期療效及安全性均良好，但兩種細胞治療的改善水平無顯著差異。

肝硬化；自體骨髓干細胞；臍帶血干細胞；細胞移植；療效

目前，干細胞在醫學領域內的應用越來越令人矚目，也為失代償期肝硬化患者的治療提供了新的方法。已有的干細胞治療的報道多采用自體骨髓干細胞、臍血干細胞、外周造血干細胞等，在臨床上取得了一定的效果[1～10]。有研究報道臍血內干細胞數量和質量較骨髓內更為優越，更具有自我更新、增殖分化和體外擴增的潛能[11～20]。本文比較了自體骨髓干細胞和臍帶血干細胞經肝動脈注入肝內治療失代償期肝硬化患者的近期療效，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇2006年12月至2012年5月在我科住院的失代償期乙型肝炎肝硬化患者65例，男42例，女23例；年齡34～60歲，平均年齡（42.2±4.5）歲。

診斷均符合2010年中華醫學會發布的《慢性乙型肝炎防治指南》。肝功能分級屬于Child-Pugh B/C級。無感染和原發性肝癌等并發癥。將患者隨機分為自體骨髓干細胞治療組33例和臍帶血干細胞治療組32例。兩組患者基線指標無顯著性差異。

1.2 基礎治療兩組在治療前或在治療的同時已經開始接受核苷類藥物抗病毒治療。給予兩組患者谷胱甘肽（古拉定，意大利斯德大藥廠）1.2g，加入5%葡萄糖注射液100ml中靜脈滴注，1次/d，門冬氨酸鉀鎂注射液30ml、維生素C 3.0，加入10%葡萄糖注射液250ml中靜脈滴注，1次/d。

1.3 術前準備及干細胞分離與治療患者在術前

簽署自體骨髓干細胞或臍帶血干細胞治療知情同意書，做好心理護理，減輕患者的緊張和恐懼心理。雙側腹股溝備皮，行碘過敏試驗。在無菌條件下，選擇兩側髂后上棘為穿刺點，消毒、局部麻醉，以18號骨髓穿刺針穿刺，抽取骨髓血160～190 ml，肝素抗凝。在婦產科醫生的協助下選擇HBsAg、抗HCV、抗HIV和抗梅毒螺旋體抗體陰性的健康產婦，在孕婦分娩后馬上取其臍帶血60～100 ml，配血型，與患者血型相同。應用寧夏中聯達生物有限公司生產的細胞分離試劑盒分離干細胞，將臍帶血轉移至A液瓶內，加入B液，充分混勻，室內靜置約20～30 min，觀察到A液瓶內有明顯的紅細胞沉降層后，將上清液轉移至50 ml離心管中，2500 r/m離心5 min，棄去上清液，每管加注生理鹽水，最后收集在一個50 ml離心管中。取2支新的50 ml離心管，各加入25 ml C液，將收集到的細胞懸液加入到含有25 ml C液的離心管中，1800 r/m離心30 min。仔細地吸取中間云霧狀細胞層。加生理鹽水至50 ml，2500 r/m離心5 min，棄去上清液，加入生理鹽水，混勻，1800 r/m離心5 min，如此共洗滌3次，最后棄去上清液，適量稀釋存在于離心管最底部的細胞，保存于5 ml試管中。取100 μl細胞懸液進行細胞計數。本組分離的臍帶血干細胞數目在1～5×107之間。在放射介入條件下，經股動脈插管至肝固有動脈，將分離好的細胞懸液注入肝內，穿刺點處加壓包扎，術后術側下肢制動8h，3d內避免過度運動。預防性應用頭孢唑林2g/12h，靜脈滴注，連用3d。

1.4 臨床檢測采用速率法檢測肝功能（廣州標佳公司）；采用雅培公司提供的原裝試劑檢測凝血功能指標；采用放射免疫法檢測AFP（北京北方生物試劑研究所）。

1.5 統計學處理應用SPSS16.0軟件進行統計分析。計量資料以（）表示，組間比較用成對資料的t檢驗，計數資料采用x2檢驗，P＜0.05為統計學上有顯著性差異。

2 結果

2.1 患者自覺癥狀改善情況在治療后第3天，兩組全部患者乏力、納差癥狀有改善，兩組間差異無顯著性（P＞0.05）。

2.2 肝功能和PTA改善情況如表1所示，在治療后8w，骨髓細胞和臍血細胞移植患者肝功能指標無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 不同Child-Pugh分級患者治療前后肝功能指標的變化情況見表2和表3。

2.4 不良反應兩組均未發現明顯的不良反應及并發癥。

表1 兩組患者肝功能和AFP（）的比較

表1 兩組患者肝功能和AFP（）的比較

與骨髓干細胞移植組比，①P＞0.05

例數ALB（g/L）PTA（%）ALT（IU/L）TBIL（μmol/L）AFP（μg/L）骨髓33治療前27.5±6.348.8±13.450.4±11.130.6±14.710.±4.7治療后34.6±7.155.5±11.245.6±12.328.1±13.511.3±4.1臍血32治療前26.6±8.047.5±12.552.5±10.734.4±15.28.2±3.9治療后37.8±8.3①58.9±14.0①47.2±11.8①30.7±14.8①9.8±3.5①

表2 兩組Child-Pugh B級患者肝功能指標（）的比較

表2 兩組Child-Pugh B級患者肝功能指標（）的比較

與骨髓干細胞移植組比，①P＞0.05

例數ALB（g/L）PTA（%）ALT（IU/L）TBIL（μmol/L）骨髓23治療前31.0±4.660.2±7.649.0±11.324.9±13.1 8 w后37.6±6.966.0±7.440.8±13.020.8±12.9臍血24治療前8 w后30.8±4.4 39.3±7.6①61.1±7.9 67.3±8.2①50.0±12.8 43.7±12.5①23.0±12.8 21.3±13.7①

表3 兩組Child-Pugh C級患者肝?功能指標（）的比較

表3 兩組Child-Pugh C級患者肝?功能指標（）的比較

與骨髓干細胞移植組比，①P＞0.05

例數ALB（g/L）PTA（%）ALT（IU/L）TBIL（μmol/L）骨髓10治療前24.6±4.850.5±7.454.6±14.339.1±11.0 8 w后29.5±7.151.9±7.452.3±14.033.0±14.1臍血8治療前8 w后23.2±4.4 33.2±6.4①51.9±6.0 54.0±8.0①53.9±14.1 51.8±15.1①42.0±12.4 32.3±14.1①

3 討論

失代償期肝硬化是慢性肝病的終末期狀態，在我國發病率高，危害嚴重，目前臨床上缺乏特異的治療方法。如何改善終末期肝病患者的肝功能成為臨床治療的難點和熱點。近年來，隨著干細胞技術和再生醫學的發展，以干細胞為基礎的細胞治療為失代償期肝硬化患者提供了新的治療方法。干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，在一定的條件下可以分化為各種功能細胞，發揮修復組織器官的作用。

目前，有關干細胞治療失代償期肝硬化患者的報道較多，且取得了較好的療效。已有的報道多采用自體骨髓干細胞、臍血干細胞、外周血造血干細胞等[1～10]。與骨髓和外周血干細胞相比，臍帶血干細胞具有更強的增殖分化能力，其免疫原性弱，移植物抗宿主病發生率低，無腫瘤細胞污染，從配型到獲得細胞時間短，成本低廉，而且臍血在基礎科研及臨床運用中較少涉及社會倫理和法律問題[11]。由于這些優點，使臍血在移植研究中作為一種特別的細胞資源，備受關注。

據報道臍帶血所含干細胞在數量和質量上明顯優于骨髓血所含干細胞。目前發現臍帶血中的干細胞有造血干細胞和間充質干細胞[12～14]。大量實驗已經證實臍帶血造血干細胞比骨髓和動員的外周血來源的造血干細胞更原始、更具有自我更新、增殖分化和體外擴增潛能。周漢超等[15]報道分離后的臍血干細胞的CD34和CD38數量明顯多于骨髓血干細胞。據報道臍帶血中的CD34+細胞所占比例與骨髓相似，但在質量上，在體外長期培養的臍血CD34+細胞中CD34+CD45+細胞明顯高于骨髓，CD34+CD38-和CD34+CD33-細胞在臍血中的比例均高于骨髓，而且臍血CD34+CD38-細胞的增殖分化能力高于骨髓[17，18]。存在于臍血中CD34+CD38-細胞群可以再動員SCID小鼠的免疫細胞，使之部分恢復細胞免疫功能[19]。此外，臍帶血中造血干/祖細胞的數量及增殖能力也均高于骨髓[20]。這些原因可能就是為什么使用少量的臍帶血來分離干細胞要比抽取大量的骨髓分離細胞來的經濟、實用。

有報道臍血干細胞治療后患者臨床癥狀和體征改善明顯高于骨髓干細胞治療后[15]，但也有報道顯示兩組患者治療效果相似，無顯著性差異[16]。本研究使用臍帶血和骨髓血干細胞治療患者65例，比較兩組發現在療效方面無顯著性差異，兩組在臨床上均取得了較好的療效，在臨床癥狀改善方面兩組間相似，臍血組在生化指標改善方面優于骨髓組，除了AST在臍血組的下降較骨髓組有顯著性差異外，余項指標臍血組均優于骨髓組，但兩組間無顯著性差異。不同的研究者報道的療效間有所差異，可能與選取的患者特征、抽取的骨髓量、臍血量、細胞分離的方法、所得細胞數量和觀察時間點等因素不同有關。總體來講，臍血干細胞治療的療效較骨髓干細胞治療有優勢，這與上述基礎研究的結果是一致的。因骨髓穿刺有創傷，且年齡大的肝病患者骨髓質量較差，所以對于年齡大于40歲以上的患者行臍帶血干細胞治療可能會更獲益。

本研究顯示，臍帶血和骨髓血干細胞治療后患者血清白蛋白水平和凝血酶原時間均有明顯的改善，說明注入肝臟的干細胞發揮了修復病損肝臟的功能，使肝臟的合成功能有了不同程度的改善。干細胞在肝臟內如何發揮作用，其具體的機制尚不清楚，推測可能的機制是干細胞進入肝臟后在肝臟的微環境中分化為實質肝細胞，或是進入肝臟的干細胞分泌一些細胞因子而促進肝細胞的再生。干細胞能夠產生重要的細胞-細胞接觸和支持造血的生長因子，還能通過誘導“歸巢”受體將干細胞融合入肝臟，進而使干細胞轉化為肝樣細胞而發揮作用，這是需要進一步研究和探討的問題。

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（收稿：2013-12-30）

（校對：陳從新）

Safetyandshort-termefficacyofautologousbonemarroworumbilicalcordbloodstemcells

transplantation through hepatic artery in treatment of patients with decompensated cirrhosis

Wang Fang,

Yun Shenghao，Zhou Xinren，et al.Department of Infectious Diseases，Anning Branch of General Hospital,Lanzhou Military Area Command，Lanzhou 730070，Gansu Province，China

ObjectiveTo investigate the safety of autologous bone marrow stem cells or umbilical cord blood stem cells transplantation in treatment of patients with decompensated cirrhosis through hepatic artery and the improvement in liver function and prothrombin activity in a short term.MethodsSixty-five patients with decompensated cirrhosis were randomly divided into bone marrow group（33 cases）and umbilicus cord blood group（32 cases）；patients in bone marrow group received autologous bone marrow stem cells transplantation through hepatic artery and the umbilicus cord blood group received umbilical cord blood stem cells through the same way；thechangesofserumalanineaminotransferase，totalbilirubin，prothrombinactivity，albuminandalphafetoprotein after 8 weeks were determined，and the improvement in symptoms and postoperative adverse reactions wereobserved.ResultsThreedaysaftercelltransplantation，patientsinbothgroupsachievedsignificantly improvement in symptom such as fatigue and anorexia but had no significantly difference between the two groups. At eight weeks post therapy，in patients of bone marrow group and umbilicus group，serum albumin level increased significantly from the baseline of（31.0±4.6）g/L to（34.6±7.1）g/L and（26.6±8.0）g/L to（37.8±8.3）g/L，prothrombin activity from（48.8±13.4）%to（55.5±11.2）%and（47.5±12.5）to（58.9±14.0）%，but the improvement did not differ between the two groups；alanine aminotransferase，total bilirubin and alpha-fetoprotein were（45.6±12.3）IU/L，（28.1±13.5）μmol/L and（11.3±4.1）μg/L respectively in patients of bone marrow group and（47.2±11.8）IU/L，（30.7±14.8）μmol/Land（9.8±35）μg/Lrespectivelyinpatientsof umbilicalgroupat8weeksposttherapy，butthe improvement did not differ between groups.ConclusionsIt issafeandeffectiveintreatmentofpatientswithdecompensated cirrhosis using autologous bone marrow stem cells and umbilical cord blood stem cells transplantation through hepatic artery and no significant difference was observed between the two group.

Cirrhosis；Autologousbonemarrowstemcells；Umbilicalcordbloodstemcells；Cell transplantation；Efficacy

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.04.006

甘肅省科技支撐計劃項目（編號：0708NKCA093）

730070蘭州市蘭州軍區總醫院安寧分院感染病科（王方，云升皓，周新人，寇俊峰，蔡國芳，陳瑞麗，楊興坤，張靜）；婦產科（馮淑嫻）

王方，女，44歲，醫學博士，主任醫師。主要研究方向為慢性肝病的發病機理和治療學研究。E-mail：kaixin919@163.com