六氯苯與雌二醇共存時內分泌干擾活性拮抗效應及其機制研究

張盼月　張光明　郎朗

摘要：以典型天然雌激素雌二醇為代表，以人體乳腺癌細胞MCF-7增殖為手段，檢驗了六氯苯與雌二醇共同作用時的內分泌干擾活性及其機理.結果發現六氯苯具有強烈的內分泌干擾活性，但與雌二醇混合后，呈現明顯的拮抗效應，內分泌干擾活性被顯著抑制.機理分析表明六氯苯、雌二醇、二者混合物都可以干擾雌激素受體和胞外信號調節激酶（ERK）信號通路、激活轉錄因子、誘導細胞增殖.路徑分析表明，六氯苯與雌二醇的拮抗作用與雌激素受體通路無關，主要原因是雌二醇降低了六氯苯對ERK的活化程度、降低了p-ERK蛋白的表達、從而干擾了絲裂原活化蛋白激酶信號轉導.轉錄因子分析表明，雌二醇弱化六氯苯內分泌干擾活性的主要原因是降低了c-Myc蛋白表達.上述發現為六氯苯的控制提供了理論依據.

關鍵詞：雌二醇；六氯苯；雌激素活性；拮抗；ERK信號通路；機理

中圖分類號：X703.1 文獻標識碼：A

內分泌干擾物（EDCs）具有生物內分泌干擾活性、可破壞免疫系統、引起多種器官和神經損傷，是目前國際研究熱點[1].我國多地檢出多種EDCs，其典型代表是六氯苯（HCB）[2].環境中的六氯苯進入生物體后，必然與天然雌激素共同發揮作用.而這方面的研究未見報導.

研究發現，有的物質混合時出現明顯的協同作用，如Dieldrin，Toxaphene，Endosulfan和Chlordane任何兩種混合，雌激素反應強度可增加160～1 600倍[3].雙酚A、異黃酮、壬基酚在低濃度下也出現明顯協同[4-5].與此同時，也有報道發現狄氏劑和毒殺酚混合后雌激素效應無協同作用[6]；而鎘與E2之間甚至出現了拮抗作用[7].上述現象表明不同EDC的混合效應不同、作用機制不同，需要逐一研究.本文選擇天然雌激的代表雌二醇（E2），研究它與六氯苯共同作用時的內分泌干擾活性及其作用機制.

1材料與方法

人體乳腺癌細胞MCF7來自哈爾濱工業大學生物系，屬ATCC細胞系.酶與蛋白標樣購自美國Sigma公司.化學試劑購自美國Ameresco公司.根據六氯苯的毒性檢測結果和生物體內E2濃度，單獨投加六氯苯濃度為10-8 mol/L，單獨投加E2的濃度為10-12mol/L，混合物的濃度為二者各取一半.所用主要設備包括GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems公司），DYY6B電泳儀（北京市六一儀器廠），蛋白質電泳及Western雜交轉膜系統（BioRad），LSM Meta510 激光共聚焦儀（Zeiss公司）和IGO 150二氧化碳培養箱（Thermo公司）.

雌激素活性檢測采用經典EScreen法，細胞增殖效應（PE）為實驗組的吸光度平均值與溶劑對照組吸光度平均值的比值[2].

采用WESTERN BLOT法測定乳腺癌MCF7細胞內雌激素受體α蛋白，以及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路相關蛋白.該方法可檢測到低至10pg的EDC干擾效應[8].以βTublin蛋白作為內參照，對目的蛋白表達量進行校正[9].采用RTPCR法測定EDCs干擾效應相關的轉錄因子，具體步驟為：細胞培養、RNA抽提、分離、沉淀、洗脫、再溶解、定量、逆轉錄、聚合酶鏈式反應、電泳鑒定[2].

每次試驗均進行三組平行試驗，每組平行實驗設定6個平行樣，共18個樣品，最終實驗數據經SPSS13.0方差分析進行處理.

2 結果與討論

2.1六氯苯與雌二醇混合后內分泌干擾活性研究

首先考察E2與六氯苯的混合對其內分泌干擾活性的影響，結果見圖1.圖1表明六氯苯明顯促進MCF7細胞增殖效應，E2在48 h時的細胞增殖效應最強，96 h時二者均失去增殖效應.二者混合后產生明顯的拮抗效應，在24 h時甚至比溶劑對照組弱.這一現象十分重要，意味著天然雌激素對六氯苯的內分泌干擾活性存在強烈的抑制，可以有效消除其內分泌干擾活性，對于保護生物體內分泌系統穩定具有重要作用.本文的結果來源于單一濃度實驗，這一拮抗現象并非決定性的結論，不同實驗條件下二者的混合效應需要進一步的實驗驗證.

2.2內分泌干擾活性路徑分析

接下來研究E2，六氯苯、兩者混合物的內分泌干擾活性路徑.EDCs干擾內分泌系統活動的路徑有多種.其中最常見的是與生物體內的雌激素受體（ER）結合，阻止天然雌激素作用，被稱為經典路徑；此外，EDCs還可以通過非經典路徑如MAPK通路發揮作用.本文同時考察了二者.

2.2.2非經典路徑分析

圖2表明經典路徑不是E2抑制六氯苯的路徑，拮抗效應可能通過MAPK信號通路起作用.MAPK信號通路中最重要的一條是外界因子激活細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）[10]，活化的ERK磷酸化多種核轉錄因子，進而參與調控雌激素活性，調節增殖相關蛋白的合成與表達.ERK的激活情況如圖3所示，E2使ERK蛋白表達量升高，六氯苯使ERK蛋白的表達量降低，混合物作用時效果與六氯苯單獨作用時接近，遠低于E2的單獨作用.

被激活的ERK蛋白轉變成pERK蛋白，如圖4所示.六氯苯能夠強烈地誘導pERK蛋白的表達，混合物對pERK蛋白表達的誘導能力與雌二醇單獨作用時強度相當、遠低于六氯苯的單獨作用.因此，推測雌二醇弱化六氯苯內分泌干擾活性的途徑主要是通過干擾ERK的活化，降低了pERK蛋白的表達.

2.3.3cJun基因

試驗發現，E2，六氯苯，混合物均能使cJun基因表達量下降8%～13%，差異缺乏顯著性.說明E2與六氯苯的拮抗作用與cJun基因表達無密切關系.

3 結論

本文研究了典型環境內分泌干擾物六氯苯與天然雌激素雌二醇共存時對人體乳腺癌細胞MCF7的增殖效應.結果發現，六氯苯與雌二醇均有較強的內分泌干擾活性、可誘導MCF7細胞增殖；二者共存時呈現明顯的拮抗作用，這對減輕六氯苯的內分泌干擾活性具有重要意義.由于本文是單一濃度實驗，該結論尚需進一步梯度實驗確認.機理研究表明，雌二醇可通過雌激素受體通路及MAPK通路發揮作用、增加DNA分裂期細胞比例.六氯苯也可以通過上述路徑發揮作用、同時增加DNA分裂期及間歇期的細胞比例、促進細胞增殖.二者混合后，拮抗效應主要是通過MAPK信號通路實現，降低pERK蛋白的表達、進而減弱cFos基因表達.

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