大鼠肝細胞癌變過程中survivin與livin的動態表達及相關性研究

李 豐 王煒 姜開文 張隆鑫

廣州醫科大學附屬第一醫院肝膽外科，廣東廣州510000

大鼠肝細胞癌變過程中survivin與livin的動態表達及相關性研究

李 豐 王煒▲姜開文 張隆鑫

廣州醫科大學附屬第一醫院肝膽外科，廣東廣州510000

目的探討大鼠肝細胞癌變過程中survivin與livin的動態表達及其二者的相互關系。方法隨機將100只SD大鼠分為模型組與對照組各50只，模型組大鼠給予0.01%DEN自由飲用18周誘導大鼠肝癌模型，對照組大鼠常規自由飲水，于4、8、12、16、18周分別處死模型組10只，對照組10只。采用免疫組化、RT-PCR、Western bolt法檢測survivin和livin的表達。結果免疫組化結果顯示：模型組大鼠survivin、livin表達總陽性率分別為82%（41/ 50）、86%（43/50），survivin與livin都表達于肝癌組織及癌旁肝組織中，且二者的表達重疊，Spearman相關分析表明，二者的表達有相關性（r=0.9027，P<0.05）。RT-PCR檢測結果顯示，肝癌組織中均有survivin mRNA和livin mRNA表達，隨著肝癌程度的加重而增加，與對照組肝組織比較，差異有統計學意義（P<0.05）。Western blot結果顯示，survivin、livin的表達隨著肝癌程度的加重而增加，對照組肝組織比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結論survivin、livin在肝癌組織中高表達，且二者的表達密切相關，為肝細胞癌的臨床治療以及預后提供理論依據。

大鼠；肝細胞癌；Survivin；Livin

肝細胞癌（HCC）是臨床中常見的腫瘤，大部分進展期的病例缺乏有效的臨床治療，日益受到重視[1]。無限的細胞增殖和損傷凋亡的不平衡是HCC重要的特征[2]。IAP家族是重要的凋亡抑制因子。目前已發現8種IAPs，作為家族的新成員，survivin被認為在腫瘤的發生、發展中扮演重要角色；livin的研究則剛剛開始，其在肝腫瘤組織中的表達研究更不完善，在我國鮮有livin在肝癌組織中的研究報道。本文用免疫組化、Western bolt、RT-PCR法檢測抗凋亡蛋白livin、survivin蛋白和mRNA在肝癌組織中的表達，探討二者之間相互關系，從而為臨床診斷和肝癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及建模健康清潔級雄性SD大鼠100只（190～200 g），購自中山大學醫學院動物中心，飼養于普通級實驗室，標準飼料喂養。隨機分為模型組、對照組，各50只。模型組大鼠0.01%DEN（飲用蒸餾水配制，Sigma公司產品，純度為99.9%）自由飲水18周[3]建立大鼠肝癌模型。對照組大鼠常規自由飲水。分別在4、8、12、16、18周處死模型組、對照組大鼠各10只。取左肝迅速進行液氮冷凍后放入-80℃冰箱以備行Western bolt、RT-PCR檢測，右肝進行固定、脫水透明、常規包埋，行免疫組織化學檢測。

1.1.2 試劑兔抗鼠livin抗體購自Sigma公司；兔抗鼠survivin抗體購自Abcam公司；Trizol購自Invitrogen公司；即用型SP試劑盒、DAB購自福建邁新生物制劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病理學檢查標本常規石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色觀察肝癌病變過程。

1.2.2 免疫組織化學法切片脫蠟、水化，3%H2O2孵育后高壓修復，兔抗livin、兔抗survivin作為一抗；應用SP免疫組織化學染色技術進行染色，DAB顯色，蘇木素復染。染色中以PBS代替一抗做空白對照，未見非特異性染色。

1.2.3 Western blot法冰浴上（4℃）將肝組織剪碎，勻漿，超聲破碎后，離心提取上清，用BCA試劑盒測量蛋白濃度，將樣品置于-20℃保存，備用。變性后，上樣總體積為20μL，總蛋白量為100μg，然后進行12%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后，濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2 h，TTBS洗滌3次，用livin、survivin抗體孵育，4℃過夜。TTBS洗滌3次，與馬抗大鼠IgG、兔抗大鼠IgG二抗，室溫孵育2 h，TTBS洗滌3次后，與堿性磷酸酶反應3～5 min。晾干后，掃描，分析，保存。

1.2.4 RT-PCR法取少量組織用液氮研磨成粉末，震蕩、離心，吸取上層，加入異丙醇、乙醇離心、沉淀，-80℃冰箱保存。Trizol試劑提取總RNA，并進行RNA定量、RNA逆轉錄及cDNA合成，RT-PCR試劑盒檢測survivin mRNA、livin mRNA水平。survivin引物上游：5'-CTTTCTCAAGGACCACCGCATC-3'，下游：5'-CAA TCCATGGCAGCCAGCTGC-3'，擴增片段為393 bp；livin引物上游：5'-TCCACAGTGTGCAGGAGACT-3'，下游：5'-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3'，擴增片段為312 bp；GAPDH引物上游：5'-AGCGCAAGTACTCCGTAGTG-3'；下游：5'-AAGCAATGCTATCACCTCCC-3'；擴增片段為501 bp。產物經含溴乙啶的1.7%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線投射儀觀察照相。

1.2.5 結果判定免疫組織化學切片由3名有經驗的病理專家在雙盲的情況下判定結果。免疫組織化學結果的判定，染色指數為染色范圍與染色強度之和，分別以-、+、++和+++表示，（-）表示整張切片陽性細胞數＜5%，未見細胞著色；（+）表示陽性細胞數占5%～25%，著色較弱；（++）表示陽性細胞數占＞25%～50%，著色較強；（+++）表示陽性細胞數＞50%，著色強。RTPCR結果以目的基因對GAPDH的相對積光密度值（T/N）記錄。Western bolt結果分析采用Quantity One軟件，計算各組蛋白表達條帶的相對灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；采用Spearman相關分析二者的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 survivin、livin在模型大鼠肝組織中的表達

survivin、livin在模型大鼠肝組織中的分布見表1，其總陽性率分別為82%（41/50）、86%（43/50），survivin表達陽性的細胞呈敞在性或灶狀分布，陽性顆粒呈黃色或棕黃色，位于細胞質中（圖1，見封三），肝癌組織及癌旁肝組織中，均有表達。livin主要表達于肝癌組織細胞質中，與survivin的表達重疊（圖1，見封三）。Spearman相關分析表明，二者的表達呈正相關（r= 0.9027，P＜0.05）。

表1 免疫組織化學檢測survivin、livin在模型大鼠肝組織中的分布（只）

2.2 survivin、livin基因及蛋白在肝癌組織中的表達

RT-PCR檢測結果顯示，肝癌組織中均有survivin mRNA、livin mRNA表達，隨著肝癌程度的加重其表達增加，在4、8、12、16、18周與對照組肝組織比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。Western blot結果顯示，肝癌組織中有survivin、livin蛋白表達，且隨著肝癌程度的加重其表達增加，在4、8、12、16、18周與對照組肝組織比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

圖2 RT-PCR檢測survivin mRNA及livin mRNA表達

3 討論

肝癌的發生、發展是一個多基因、多階段的演進過程，涉及多種原癌基因的激活和抑癌基因的失活。目前有大量研究證明，抗凋亡因子在實體腫瘤和癌癥細胞系中表達增加[4]，如凋亡蛋白抑制因子（IAPs）家族。目前已發現IAPs家族包括8種：NAIP（BIRC1）、c-IAP1（BIRC2）、c-IAP2（BIRC3）、X-linked IAP（XIAP、BIRC4）、Survivin（BIRC5）、Apollon（BRUCE、BIRC6）、Livin/ML-IAP（BIRC7）和IAP-like protein 2（BIRC8）[5]。

survivin是IAP家族中的重要成員，其可以抑制凋亡和調控有絲分裂，其在腫瘤組織以及分化差的成人組織中也有表達[6]。survivin在化療引起的細胞凋亡中起很重要的作用，被公認為是惡性腫瘤進展的重要標志物，也被認為是抗腫瘤的靶標。有研究表明survivin是可以作為預測腫瘤預后的標志物[7-8]。

圖3 Western blot檢測survivin、livin蛋白的表達

livin是IAP家族中的另一成員，有兩種同源異構體，在JNK1的參與下，其通過抑制caspase-3、caspase-7和caspased-9，達到抗凋亡的作用[9]。有研究表明，livin在許多惡性腫瘤中有表達，包括肺癌、鼻咽癌、膀胱癌、神經母細胞瘤和腎細胞癌。然而livin在惡性腫瘤表達的臨床意義不明確，在不同類型的腫瘤中，其與預后的關系仍然存在爭議。也有研究表明，IAPs在腫瘤早期不起作用，而在進展期起重要作用[10]，其相互作用的機制可能是IAPs能使突變的細胞存活，從而導致腫瘤發生。在許多惡性腫瘤中都會有survivin和IAP的表達，他們與腫瘤的惡性細胞學特征緊密相連，如腫瘤浸潤生長、總生存率的縮短、治療抵抗、復發。體外實驗中，livin的沉默能抑制HeLa細胞的增殖[11]。除此之外，有文獻報道，以livin為目的si RNAs可以抑制人類腫瘤生長[8]。

本研究中survivin、livin在肝癌模型中總陽性率分別為82%（41/50）、86%（43/50），在肝癌組織及癌旁肝組織中，兩者均有表達，且表達重疊。RT-PCR和Western blot結果顯示，survivin、livin mRNA及蛋白表達隨肝癌程度的加重而增加。推測survivin、livin與肝癌的嚴重程度相關，一定程度上可以反映腫瘤的嚴重程度，可以預測腫瘤的預后。相關性分析顯示，survivin、livin表達呈正相關，提示其二者可能共同在腫瘤的發生發展中起作用。機制可能為，IAP家族的特征是有桿狀病毒IAP重復序列（BIR）蛋白區域，是調節細胞凋亡、胞質分裂和信號轉導的關鍵因素[7]。除了BIR區域，livin所含有的指環（RING）也可以使蛋白質與E3泛素連接酶作用。IAP的E3泛素連接酶活性表現為促進caspases與TRAF2的泛素化和蛋白酶體降解。抗IAP蛋白中最主要的是Smac蛋白，起著促凋亡等共同調節細胞增殖的作用。在激活凋亡級聯反應時，線粒體釋放細胞色素c和Smac，而survivin和livin相互結合共同使Smac發揮IAP抑制作用[12-14]。相反，在正常細胞中核蛋白XAF1與XIAP結合，從而抑制IAP的抗凋亡作用。筆者推測survivin和livin在腫瘤細胞凋亡調節中具有一定的相互作用關系。

綜上所述，survivin、livin在肝癌組織中高表達，且二者的表達密切相關，為肝細胞癌的臨床治療以及預后提供理論依據。

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Dynamic expression and correlation of survivin and livin during hepatocellular carcinogenesis in rats

LI Feng WANG Wei▲JIANG Kaiwen ZHANG Longxin
Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangdong Province,Guangzhou 510000,China

ObjectiveTo determine the dynamic expression and correlation of survivin and livin during hepatocellular carcinogenesis in rats.Methods 100 SD rats were divided into model group and control group with 50 rats in each group.Rats in the model group were given 0.01%DEN for drink induced model of liver cancer,while rats in the control group were given conventional water for drink.10 rats in model group and control group were killed at 4,8,12,16,18 weeks respectively.Survivin and livin were measured by immunohistochemistry,RT-PCR,Western bolt.ResultsThe results of immunohistochemistry showed that the total positive rates of survivin and livin were 82%(41/50),86%(43/ 50)in the model group,survivin and livin expressed in hepatic cellular cancer tissues and para-carcinoma tissue,the expression of them was overlapping.Spearman correlation analysis showed that the correlation between them was positive(r=0.9027,P<0.05).The results of RT-PCR showed that survivin mRNA and livin mRNA were expressed in hepatic cellular cancer tissues,increased with the liver cancer degree,compared with the control group,the difference was statistically significant(P<0.05).The results of Western blot showed that the expression of survivin and livin increased with the increase of hepatocellular carcinoma of liver tissue.There was statistically significant difference compared with the control group(P<0.05).ConclusionSurvivin and livin are highly expressed in hepatic celluar Cancer tissues,and the expression of them are closely related.The results may provide a theoretical basis for the clinical treatment and prognosis of hepatocellular carcinoma.

Rat;Hepatocellular carcinoma;Survivin;Livin

R735.7

A

1673-7210（2014）03（b）-0027-04

2013-05-10本文編輯：程銘）

國家自然科學基金項目（編號30571829）。

▲通訊作者