凝聚胺法與微柱凝集法檢測孕婦IgG血型抗體效價應用比較

潘小良 宋朝暉 梁巧米 王 敏

1.杭州市第一人民醫院輸血科，浙江杭州310006；2.山東省醫學科學院附屬醫院婦科，山東濟南250031

凝聚胺法與微柱凝集法檢測孕婦IgG血型抗體效價應用比較

潘小良1宋朝暉1梁巧米1王 敏2

1.杭州市第一人民醫院輸血科，浙江杭州310006；2.山東省醫學科學院附屬醫院婦科，山東濟南250031

目的比較凝聚胺法與微柱凝集法檢測孕婦IgG血型抗體效價的效果。方法選擇2012年1月～2013年1月杭州市第一人民醫院就診的ABO血型不合的O型孕婦380例為研究對象，分別采用凝聚胺法與微柱凝集法檢測IgG抗A（B）效價，比較兩種檢測方法的效率；分析ABO血型不合孕婦IgG抗A（B）效價與妊娠次數及年齡的關系。結果①在380例ABO血型不合孕婦中，＞1次妊娠孕婦檢出IgG抗A（B）效價≥1∶64者所占比例[77.5%（110/142）]多于1次妊娠者[39.5%（94/238）]，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；年齡31～40歲孕婦IgG抗A（B）效價≥1∶64者[61.4%（156/254）]多于21～30歲孕婦[38.1%（48/126）]，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。②380例血型不合孕婦中，微柱凝集法檢測IgG抗A（B）效價≥1∶64者共352例，IgG抗A（B）效價＜1∶64者28例，凝聚胺法檢測IgG抗A（B）效價≥1∶64者共302例，＜1∶64者78例，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論微柱凝集法有操作簡便、結果準確、敏感性高、易標準化等諸多優點，更具臨床應用價值。

新生兒溶血病；凝聚胺法；微柱凝集法；IgG抗A（B）效價

新生兒溶血病（haemolytic disease ofthe newborn， HDN）特指母嬰血型不合引起胎兒或者新生兒的免疫性溶血性疾病，其中尤以ABO血型系統不合的最為常見，主要由IgG抗-A及抗-B抗體引起，多發生于O型母親所生的非O型新生兒[1]。孕婦IgG抗A（B）效價測定是HDN產前診斷有效手段，在HDN診治中發揮著重要作用。為了探尋更具臨床價值的檢測方法，筆者對較新的微柱凝集法與常用的凝聚胺法進行了比較分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1月～2013年1月杭州市第一人民醫院就診的夫婦血型不合的O型孕婦380例為研究對象，丈夫為A型者測IgG抗-A，丈夫B型的測IgG抗-B，丈夫AB型的同時測IgG抗-A和抗-B。孕齡24～40周；孕婦年齡21～40歲。采用凝聚胺法再次測定抗體效價，為避免RH系統的干擾，所選孕婦均為RHD陽性，且不規則抗體篩檢陰性。

其中按照ABO血型檢測系統，入選孕婦中首次妊娠者共計238例，既往有妊娠史包括流產史者共142例；按照孕婦年齡分為21～30歲組（126例）和＞30～40歲組（254例）。

1.2 儀器

BASO血庫專用離心機；DiaMed（達亞美）凝膠卡專用孵育器和離心機。

1.3 試劑

0.01 mol/L二硫蘇糖醇（DTT）：取0.77 g DTT溶于500 mL生理鹽水；DiaMed公司的2號稀釋液和Liss/Coombs凝膠卡；0.8%及5%的A型和B型紅細胞懸液用獻血員血液自制；上海血液生物醫藥公司的抗A抗B定型試劑、IgM抗D試劑、篩選細胞；珠海BASO公司凝聚胺試劑盒。

1.4 方法

1.4.1 微柱凝集法孕婦血清200μL+0.01 mol/L的DTT溶液200μL，混勻后置37℃孵育30 min，以破壞IgM類抗體。另取潔凈試管8支，編號1～8，第1管加達亞美2號稀釋液300μL，其余7管各加稀釋液200μL。取孵育后血清100μL加于第1管，混勻，取出200μL加入第2管，依次倍比稀釋，第8管取出200μL棄去。這樣1～8管的稀釋度分別是1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024。取出達亞美Liss/Coombs卡，做好標記，各孔加入0.8%的A型（或B型）紅細胞懸液50μL，再分別加1～8號管中不同稀釋比的液體25μL。將加好樣的凝膠卡置于專用孵育器內，37℃孵育15 min。將孵育好的凝膠卡置于專用離心機，1000 r/min離心10 min。判讀結果：1～8管的IgG抗-A（抗-B）效價分別為8、16、32、64、128、256、512和1024。

1.4.2 凝聚胺法取潔凈小試管10支，編號1～10，第1管加0.01 mol/L的DTT溶液100μL及孕婦血清100μL，混勻后37℃孵育30 min。其余9管各加等滲鹽水100μL。從孵育后第1管吸取100μL加入第2管混勻，吸取100μL加入第3管，依次做倍比稀釋，第10管取100μL棄去。各管分別加5%A型（或B型）紅細胞懸液1滴，混勻，各加低離子液（LIM）0.65 mL，混勻，各加凝聚胺（Polybrene）溶液2滴，混勻后3400 r/min離心10 s。倒去上清液，但不能瀝干，管底約需殘留0.1 mL液體。輕輕搖動，觀察紅細胞是否凝集，若不凝集則實驗失敗。最后滴加懸浮液（resuspending）2滴，輕搖試管，觀察凝集是否散開，肉眼為不凝者需鏡檢核實。以最高稀釋度凝集管確定抗體效價，1～10管分別是2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024。

1.4.3 血型鑒定ABO血型鑒定、RHD血型及不規則抗體篩檢根據操作規程[2]。

2 結果

2.1 孕婦血清IgG-A或IgG-B抗體效價測定

在380例ABO血型不合孕婦中，＞1次妊娠孕婦檢出IgG抗A（B）效價≥1∶64者比例[77.5%（110/ 142）]多于1次妊娠者[39.5%（94/238）]，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；年齡＞30～40歲孕婦IgG抗A（B）效價≥1：64者[61.4%（156/254）]多于21～30歲孕婦[38.1%（48/126）]，差異有高度統計學意義（χ2=9.24，P＜0.01）。見表1。

表1 ABO血型不合孕婦IgG-A或IgG-B抗體效價與妊娠次數及年齡的關系[n（%）]

2.2 兩種檢測方法在IgG抗A（B）效價中的效率比較

380例血型不合孕婦中，微柱凝集法檢測IgG抗A（B）效價≥1∶64者共352例，IgG抗A（B）效價＜1∶64者28例，凝聚胺法檢測IgG抗A（B）效價≥1∶64者共302例，＜1∶64者78例，兩者≥1∶64者所占比例比較，差異有統計學意義（χ2=4.87，P＜0.05）。見表2。

表2 兩種檢測方法在IgG抗A（B）效價中的效率比較[n（%）]

3 討論

HDN起源于胎兒從父親方繼承了母親方所沒有的紅細胞抗原，這些抗原可能受到來自母血的免疫抗體的攻擊，因為母體的IgG類抗體可以自由通過胎盤屏障，使胎兒紅細胞遭受破壞，出現黃疸、水腫、肝脾腫大、貧血，甚至死胎、新生兒死亡等溶血癥狀。在所有抗體中，只有IgG類抗體能夠通過胎盤，因此只有IgG才可能引發HDN。造成ABO血型系統HDN的抗體主要是IgG抗-A和IgG抗-B，這些抗體常常無需經過明顯的免疫刺激就可“天然”存在于一些O型人體內，所以O型孕婦第一胎就可能發生HDN，這有別于Rh系統的HDN[3]。IgG抗-A（B）的濃度（效價）是影響ABO HDN嚴重程度的重要因素，一般認為抗體效價≥64才可能造成HDN，所以，當母體抗體效價≥64時，發生HDN的可能性就較高了。當然，HDN的嚴重程度還受新生兒ABO抗原的強弱、不同IgG亞類和胎盤功能等因素影響[4]。

凝聚胺（polymatching）法首先利用低離子介質降低溶液的離子強度，減少紅細胞周圍的陽離子云，促進血清中的抗體與紅細胞相應抗原結合，再加入帶正電荷的高價陽離子多聚物一凝聚胺，中和紅細胞表面存在的大量負電荷，縮短細胞間距，形成可逆的非特異性聚集，并使IgG型抗體能直接凝集紅細胞。加入中和液后，僅由凝聚胺引起的非特異性聚集，會因電荷中和而分散，而由抗體介導的特異性凝集則不會散開[5]。本試驗是紅細胞膜抗原與抗體在凝膠介質中發生的凝集反應，通過具有分子篩作用的凝膠顆粒構成的膠體介質，使游離紅細胞和聚集紅細胞得以分離。手工凝聚胺可用于不完全抗體的測定與鑒定及交叉配血。本法的特點是：靈敏度比抗球蛋白法高1～20倍，速度快，準確度高于酶試驗[6]。微柱凝集作為一項免疫學檢測新技術，是凝膠過濾技術和抗原抗體反應的結合，在歐美等發達國家已作為常規性檢測技術應用于臨床[7]，由于凝膠顆粒具有分子篩作用，抗原抗體反應后的紅細胞通過離心經過微柱，無IgG結合的紅細胞穿過凝膠到達底部，而紅細胞上若有IgG抗體結合則會被凝膠中的抗IgG拉住，紅細胞被阻止在凝膠柱上層或中間。本法有操作簡便、結果準確、敏感性高、標本量少、易標準化等諸多優點[6]。具體表現為：①簡便。操作如同試管法及玻片法一樣簡單、方便，樣本不需要經過洗滌，對陰性結果不需要確證實驗，適用于大量標本檢測，解決了抗球蛋白試驗因程序復雜耗時較長而未能在臨床常規應用的問題。多份檢測標本一次離心即出結果，有利于臨床大量標本應用，單份標本多項指標一次離心出結果，簡化了實驗程序。②準確。結果清晰明確，可重復性強，將凝集結果從傳統的顯微鏡下平面識別模式轉換至卡式立體肉眼判斷，避免因經驗不足對結果判斷的影響。③敏感。微柱凝集法對臨床不完全抗體的檢測敏感性恰到好處，假陽性和假陰性率均低。④結果保存時間長。室溫條件下，試驗結果即標本原始反應格局一般可保存數日至數周。其結果還可以拍照存檔，數據可以永久保存，并可以遠程傳輸，甚至允許遠程多方會診。⑤標本用量少。其標本量僅為傳統試管法的1/10～1/5，尤其有利于新生兒及某些特殊血液病標本的檢測。⑥標準化。微柱凝集卡、檢測試劑、專用離心機、判讀儀及工作程序和結果判定均易于規范化、標準化。⑦安全。整個操作過程能夠最大限度減少接觸血液標本及病原微生物的機會，減少醫源性感染。但是，微柱凝集技術也有其局限性，由于需嚴格按照試劑盒操作規程操作，使得工作人員的依賴性增大，不利于專業技術的積累和提高。微柱凝集檢測系統是商業化產品，因此其成本較傳統的血清學試驗（如凝聚胺技術）高出許多。微柱凝集抗人蛋白試驗及微柱凝膠免疫檢測技術的本質是血凝試驗，這在理論上為制備抗原抗體包被的紅細胞為指示紅細胞，以間接血凝試驗來檢測紅細胞抗原抗體以外的其他血液細胞、腫瘤標志物、病原微生物，以及機體其他可溶性抗原抗體，如對藥物抗體、自身抗體等的檢測都提供了比傳統血凝試驗更加敏感、準確、簡便的方法。所以說微柱凝集技術必將在臨床醫學各個領域有更為廣闊的發展。

盡管凝聚胺法與微柱凝集法都是檢測不完全抗體的敏感方法，但本次比對發現，在應用于IgG抗體效價方面，微柱凝集法的敏感度遠高于凝聚胺法，絕大多數標本的結果相差1～2個量級，差異程度遠高于其他研究結果[8-11]。本研究結果中，妊娠次數＞1次的孕婦其產生IgG抗A（B）效價≥1∶64的比例高于僅有1次妊娠者，且＞30～40歲間的孕產婦其出現IgG抗A（B）效價≥1∶64者比例高于21～30歲者，說明高齡及有多次妊娠的產婦其出現ABO-HDN的概率較高，臨床上應尤其對符合上述特點的孕婦定期進行IgG抗A（B）效價檢查，對IgG抗A（B）效價≥1∶64者及時采取相應預防及治療手段。未發現兩種方法的結果差異性在檢測不同抗體（抗-A與抗-B）中有所不同。快速準確測定IgG抗體效價，能在預測ABO HDN的發生及疾病程度上為臨床提供有效的信息。臨床上通常以效價64作為有可能發生HDN的臨界指標，更為敏感的微柱凝集法能夠更早發現孕婦IgG抗體的異常，可盡早醫學干預，因而也具有更大的臨床價值。鑒于傳統的凝聚胺法與微柱凝集法靈敏度的較大差異，測定的結果不具直接可比性，建議實驗室建立兩種方法各自不同的參考值。

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Comparison of the application of polybrene method and micro-column agglutination assay in the detecting of IgG blood antibody of pregnant women

PAN Xiaoliang1SONG Chaohui1LIANG Qiaomi1WANG Min2
1.Department of Blood Transfusion,the First People's Hospital of Hangzhou City,Zhejiang Province,Hangzhou 310006,China;2.Department of Gynaecology,Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences,Shandong Province,Ji′nan 250031,China

ObjectiveTo compare the effect of polybrene method and micro-column agglutination assay in detecting of pregnant women maternal IgG blood antibody.Methods380 O blood type pregnant women with ABO blood type incompatibility in the First People's Hospital of Hangzhou City from January 2012 to January 2013 were selected as study objects.Polybrene method and micro-column agglutination assay were used to detect the titer of IgG blood antibody, the efficiency of the two methods was compared.The relationship of IgG-A and IgG-B blood antibody titer and number of pregnancies,age in O blood type pregnant woman of ABO blood type incompatibility was analyzed.Results①The percentage of IgG-A,IgG-B blood antibody titer≥1∶64 in pregnant woman with＞1 time of pregnancy[77.5%(110/142)] was more than that in pregnant woman with 1 time of pregnancy[39.5%(94/238)],the differences were statistically significant(P＜0.05).The percentage of IgG-A,IgG-B blood antibody titer≥1∶64 in pregnant woman of 31-40 years old[61.4%(156/254)]was more than that in pregnant woman of 21-30 years old[38.1%(48/126)],the differences were statistically significant(P＜0.05).②352 cases of IgG blood antibody titer≥1∶64 and 28 cases of IgG blood antibody titer＜1∶64 were found by the method of polybrene,302 cases of IgG blood antibody titer≥1∶64 and 78 cases of IgG blood antibody titer＜1∶64 were found by the method of micro-column agglutination,the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionMicro-column agglutination method has the advantage of easy operation,consequence accuracy,high sensibility,and has more clinical application value.

Haemolytic disease of the newborn;Polybrene;Micro-column agglutination;IgG-A and IgG-B blood antibody titer

R446

A

1673-7210（2014）03（b）-0085-04

2013-11-12本文編輯：任念）

山東省醫藥衛生科技發展計劃項目（編號2011AS10363）。

潘小良（1967.4-），男，副主任技師；研究方向：醫學檢驗、臨床輸血、新生兒溶血。