多指標綜合評價優選丹參提取工藝

趙 輝 王麗萍 陳 琳 張華潭 李春花 黃秀英

1.河北省保定市第一醫院，河北保定071000；2.河北醫科大學研究生學院，河北石家莊050091；3.河北醫科大學中藥藥劑教研室，河北石家莊050091；4.河北省保定市第四醫院，河北保定071000）

多指標綜合評價優選丹參提取工藝

趙 輝1王麗萍1陳 琳2張華潭2李春花3黃秀英4

1.河北省保定市第一醫院，河北保定071000；2.河北醫科大學研究生學院，河北石家莊050091；3.河北醫科大學中藥藥劑教研室，河北石家莊050091；4.河北省保定市第四醫院，河北保定071000）

目的優選丹參脂溶性及水溶性成分最佳提取工藝。方法采用正交設計，以丹參酮ⅡA、丹酚酸B為測定指標，用高效液相色譜法測定其含量，并以二者含量為綜合指標，加權評分，優選最佳提取工藝。結果最佳提取工藝為：6倍量70%乙醇，提取3次，每次2.5 h。結論優選的提取工藝合理、可行。

丹參；提取工藝；正交試驗；丹參酮ⅡA；丹酚酸B

人參強心滴丸由人參、丹參、生地黃、蟾酥四味中藥組成，具有益氣養陰，活血強心的功效。丹參是其主要組成藥味，含有二萜醌類脂溶性及酚酸類水溶性成分。脂溶性成分具有活血化瘀、抗菌、抗急性缺氧、抗心律失常、改善血管平滑肌、抗心肌肥厚、抗血小板聚集等作用；水溶性成分具有抗血小板聚集、抗凝血和抗血栓形成、抑制細胞內源性膽固醇合成、防止脂質沉積及動脈粥樣硬化斑塊等作用[1-2]。目前，對丹參提取研究往往側重于一類成分，同時考慮到兩類成分的研究較少，本研究為提高人參強心滴丸的臨床療效，兼顧丹參脂溶性及水溶性兩類有效成分，以丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量為考察指標，對丹參的提取工藝進行全面優選。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），VWD紫外檢測器（美國安捷倫科技公司），Agilent Chemstation System色譜工作站（美國安捷倫科技公司），安捷倫柱溫箱（美國安捷倫科技公司，型號：G1316A），METTLER十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試劑與藥材

丹參酮ⅡA（批號：110766-200518）和丹酚酸B（批號：110562-200504）對照品均購于中國藥品生物制品檢定所，丹參藥材購于石家莊樂仁堂藥店，經侯芳潔老師鑒定符合《中國藥典》2010年版一部相關項下規定，乙腈（色譜純，美國Grace公司，批號：10102501），甲醇（色譜純，德國Fisher Scientific公司，批號：061495-053786），娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 丹參酮ⅡA色譜條件

Agilent ZORBAXDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm），流動相：甲醇-水（80∶20），流速：1.0 mL/min，檢測波長：270 nm[3]，柱溫：室溫，進樣量：20μL。

2.1.2 丹酚酸B色譜條件

Agilent ZORBAXDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm），流動相：乙腈-甲醇-甲酸-水（10∶30∶1∶59），流速：1.0 mL/min，檢測波長：286 nm，柱溫：室溫，進樣量：20μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備[4]

2.2.1.1 丹參酮ⅡA取經五氧化二磷減壓干燥24 h的丹參酮ⅡA對照品約20 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，得丹參酮ⅡA對照品儲備液。

2.2.1.2 丹酚酸B取經五氧化二磷減壓干燥24 h的丹酚酸B對照品約18 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，75%甲醇定容，得丹酚酸B對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備

稱取丹參藥材10 g，以8倍量70%乙醇提取兩次，時間分別為1.5、1 h，濾過，合并提取液，濃縮至近干，加甲醇定容至250 mL，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適應性實驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣。結果表明，對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應位置上有相同保留時間的色譜峰，且紫外吸收光譜圖一致，吸收峰與其他色譜峰能達到基線分離，且峰形穩定。理論塔板數按丹參酮ⅡA峰、丹酚酸B峰計算均不低于5000。見圖1。

2.3.2 標準曲線的制備

2.3.2.1 丹參酮ⅡA精密移取對照品溶液1、2、3、4、6、8 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，作為標準溶液，測定標準溶液及丹參酮ⅡA對照品儲備液峰面積。以丹參酮ⅡA濃度（X，mg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，得回歸方程：Y=49 592 086.0080X-44 976.6300（r=0.9999，n=7），結果表明：在0.021～0.210 mg/mL范圍內，丹參酮ⅡA的峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.3.2.2 丹酚酸B精密移取對照品溶液1、2、3、4、6、8 mL分別置于10 mL容量瓶中，用75%甲醇定容，作為標準溶液，測定標準溶液及丹酚酸B對照品儲備液峰面積。以丹酚酸B濃度（X，mg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，得回歸方程：Y=10 425 847.2879X-1375.0068（r=0.9993，n=7），結果表明：在0.0192～0.192 mg/mL范圍內，丹酚酸B的峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度實驗

分別取丹參酮ⅡA、丹酚酸B對照品溶液，按相應色譜條件，連續進樣6次，記錄丹參酮ⅡA、丹酚酸B的峰面積，丹參酮ⅡA峰面積的RSD為0.86%（n= 6），丹酚酸B峰面積的RSD為0.94%（n=6），結果表明儀器精密度良好。

圖1 丹參酮ⅡA對照品、丹參樣品、丹酚酸B HPLC色譜圖

2.3.4 穩定性實驗

分別取丹參酮ⅡA、丹酚酸B對照品溶液和樣品溶液，按相應色譜條件，在0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄丹參酮ⅡA、丹酚酸B的峰面積，結果丹參酮ⅡA、丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.24%（n=6）、1.11%（n=6）和1.03%（n=6）、0.98%（n=6），表明丹參酮ⅡA、丹酚酸B溶液和樣品溶液在24 h內均穩定。

2.3.5 重現性實驗

稱取丹參藥材6份，每份10 g，按“2.2.2”項下制備6份供試品溶液，進行含量測定，結果丹參酮ⅡA與丹酚酸B含量的RSD分別為1.61%（n=6）、1.34%（n=6），表明該方法重現性良好。

2.3.6 加樣回收率

精密移取已知含量的供試品溶液9份，3份為一組，分別添加丹參酮ⅡA與丹酚酸B對照品儲備液1.85、2.30、2.75、3.40、4.25、5.10 mL，測定，結果丹參酮ⅡA與丹酚酸B平均回收率分別為100.06%、99.69%，RSD分別為0.3226%（n=9）、0.4935%（n=9）。表明該方法測定丹參中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量準確、可靠。見表1、2。

表1 丹參酮ⅡA加樣回收率

表2 丹酚酸B加樣回收率

2.4 正交試驗設計[5-6]

確定乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數為4個考察因素，采用L9（34）正交表安排實驗，以丹參酮ⅡA、丹酚酸B含量為指標，運用加權評分法對丹參的提取工藝進行優選。因素水平表見表3，正交實驗見表4。

表3 因素水平表

表4 正交實驗結果

2.5 結果分析

由正交表可知，各因素影響大小順序為D＞A＞C＞B，即提取次數＞乙醇濃度＞提取時間＞乙醇用量。最佳提取工藝為A3B2C2D3，即6倍量70%乙醇提取3次，每次2.5 h。

2.6 最佳工藝驗證

根據正交實驗結果，按丹參最佳提取工藝，提取三批藥材，測定，結果丹參酮ⅡA含量分別為2.52、2.54、2.58 mg/g；丹酚酸B含量分別為4.29、4.27、4.34 mg/g；兩種成分含量綜合評分，在九組試驗中皆為最高，說明本次正交實驗所篩選的工藝是合理的。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

本研究采用平行試驗法對提取溶劑進行篩選，以水、10%、30%、50%、60%、70%、85%、95%乙醇為提取溶劑。結果表明乙醇濃度越高，測得丹參酮ⅡA的含量較高；乙醇濃度越低，測得丹酚酸B含量較高。兼顧二者，根據平行試驗結果確定60%、70%、80%三個水平進行正交實驗。

3.2 溶液的儲存

丹參酮ⅡA具有不穩定性，易發生化學降解，降解速度與水、熱密切相關[6-10]且對光不穩定。故其對照品溶液及供試品溶液均應避光放置，且操作宜迅速、避光，以免分解。

3.3綜合評分的確定[11-12]

丹參中主要含有兩類有效成分，一類是以丹參酮ⅡA為代表的脂溶性成分，另一類是以丹酚酸B為代表的水溶性成分，兩類成分所產生的功效對于人參強心滴丸都有重要意義，為此，筆者采取正交試驗綜合評分優選最佳工藝。由于藥材中丹酚酸B的含量約為丹參酮ⅡA的2倍，故在加權評分時，將所測丹酚酸B含量除以2，以使兩者在評價系統中所占權重盡量一樣，保證了評分的合理性。

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Multi-index evaluation of integration technique for extracting of Salvia Miltiorrniza

ZHAO Hui1WANG Liping1CHEN Lin2ZHANG Huatan2LI Chunhua3HUANG Xiuying4
1.The First Hospital of Baoding City,Hebei Province,Baoding 071000,China;2.College of Past-graduate,Hebei Medical University,Hebei Province,Shijiazhuang 050091,China;3.Teaching and Research section of Chinese Medicine Pharmaceutical,Hebei Medical University,Hebei Province,Shijiazhuang 050091,China;4.The Fourth Hospital of Baoding City,Hebei Province,Baoding 071000,China

ObjectiveTo optimize an integration technique for extracting the liposoluble and water-soluble components of Salvia.MethodsSalvianolic acid B and TanshinoneⅡA were selected as marker components and determined by HPLC to optimize the integration extract process of Salvia by orthogonal test.ResultsThe best extraction process was that,Salvia was added with 6 times alcohol of 70%and extracted 2.5 hours for 3 times.ConclusionThis extraction method can be employed to reduce time,working and be suitable for the morden production.

Salvia Miltiorrniza;Integration technique for extracting;Orthogonaltest;TanshinoneⅡA;Salvianolic acid B

R283

A

1673-7210（2014）03（b）-0101-04

2013-06-18本文編輯：衛軻）

河北省衛生廳中醫、中西醫結合科研計劃項目（編號2008004）。

李春花，教授，碩士生導師；研究方向：中藥制劑新技術新方法。