PD-118057藥物拯救負顯性機制E637K-hERG通道的研究

樓鈳楠，周建慶，毛海燕，葛世俊，沈文均，陳燮晶，麻付勝

PD-118057藥物拯救負顯性機制E637K-hERG通道的研究

樓鈳楠，周建慶，毛海燕，葛世俊，沈文均，陳燮晶，麻付勝

目的探討PD-118057對于糾正負顯性機制E637K-hERG蛋白轉(zhuǎn)運障礙的作用。方法全細胞膜片鉗技術檢測PD-118057干擾各種細胞模型前后hERG編碼的快速激活延遲整流性鉀電流（IKr）變化；采用Western blot分析PD-118057負顯性機制E637K-hERG蛋白轉(zhuǎn)運障礙。結果PD-118057干擾WT-hERG后，激活電流和尾電流的電流幅度都較干擾前明顯增大，但不改變通道電流的特性，只加速了通道電流的穩(wěn)態(tài)失活速度。而PD-118057干擾WT/E637K-hERG前后電流幅度和通道特性都沒有明顯變化。Western blot結果與膜片鉗結果相符合。結論PD-118057不能糾正負顯性機制E637K-hERG通道功能。

快激活延遲整流性鉀離子電流；藥物評價；PD-118057

近年來，新發(fā)現(xiàn)的hERG/KCNH2通道激活劑能夠增大快激活延遲整流性鉀電流（IKr）而不引起hERG通道阻滯。根據(jù)通道激活劑激活的電生理特性分為兩類，RPR260243為經(jīng)典的I型hERG通道激活劑，而PD-118057是2型hERG通道激活劑[1]。Zhou等[2]研究發(fā)現(xiàn)，PD-118057能夠顯著性增大IKr電流而不影響hERG通道特性。另外有研究報道，另一種2型hERG通道激動劑NS1643能夠糾正位于S6區(qū)域的Phe656突變，而尚未有報道關于PD-118057對hERG突變體影響的研究。本實驗旨在探討PD-118057對WT-hERG和WT/E637K-hERG電流幅度和離子通道特性的影響，以及PD-118057對糾正負顯性機制E637K-hERG蛋白轉(zhuǎn)運障礙的作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗分組實驗分野生型（WT-hERG）、雜合型（WT/E637K-hERG）及突變型（E637K-hERG）三個細胞模型。每個細胞模型又分實驗組（PD-118057孵育）和對照組（未加入PD-118057）。

1.2 材料質(zhì)粒pGEM-HERG、pcDNA3購自美國Invitrogen公司；載體pGEM-T購自美國Promega公司；DMEM（Dulbecco'sModified Eagle M edium）購自美國Thermo scientific公司；轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectam inTM 2000）購自美國Invitrogen公司；PD-118057購自美國Sigma公司；兔抗hERG多克隆抗體購自以色列A lomone公司；蛋白裂解液PMSF購于北京Solarbio公司；堿性磷酸酶標記的山羊抗兔抗體及BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒均購于北京ZSGB-BIO公司；引物合成及測序由TaKaRa公司完成；PCR擴增儀PE 7700購自美國PE公司；膜片鉗系統(tǒng)及分析軟件為美國Axon公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 pGEM-HERG-E637K突變體構建HERG cDNA通過Bam HI和EcoRI酶切位點插入到pcDNA3載體中。擴增引物利用PrimerPrem ier5.0軟件設計兩條HERG基因外側(cè)端引物；另外以pGEMHERG為模板，根據(jù)突變位點設計引物。聚合酶鏈反應法（PCR）構建HERGE637K突變片段，將構建的目的片段重組至pGEM-T載體進行測序鑒定。

1.3.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及藥物干擾

HEK293細胞常規(guī)用含10%FBSDMEM培養(yǎng)基，放置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將3.2 gWT-hERG質(zhì)粒和/或3.2 g E637K-hERG質(zhì)粒，根據(jù)Lipofectam inTM 2000說明書提供的實驗步驟，瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞，構建WT-hERG，WT/E637K-hERG及E637K-hERG細胞模型。同時共轉(zhuǎn)染0.8 g綠色熒光蛋白pRK5-GFP以監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率。24h后在HEK 293細胞培養(yǎng)及中加入PD-118057，終濃度為3 mol/L，繼續(xù)孵育24或48h。

1.3.3 全細胞膜片鉗記錄法室溫下（24～26℃）采用全細胞膜片鉗技術觀察PD-118057對WT-hERG，WT/ E637K-hERG，E637K-hERG IKr電流的影響。細胞外液：NaCl137mmol/L，KCl 4 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，M gCl2· 6H2O 1mmol/L，glucose10mmol/L，HEPES 10 mmol/L（用NaOH將pH調(diào)至7.4）。電極內(nèi)液：KCl130mmol/L，MgCl21 mmol/L，EGTA 5 mmol/L，M g-ATP 6 mmol/L，HEPES 10mmol/L（用KOH將pH調(diào)至7.2）。設置激活電流方案：細胞鉗制在－80mV，測試電壓從－60mV，以10mV的階躍，刺激到+60m V，持續(xù)2s；然后去極化到－40mV，持續(xù)4s；最后回到－80m V。擬合用Boltzmann方程：I=Imax×[1+exp（V1/2－Vm）/k]－1（其中Imax為最大激活電流，V1/2為半激活最大電壓，k表示斜率因子）。失活電流刺激程序：測試電壓從－130m V開始刺激，以10mV階躍幅度增長，到達20mV時鉗制并記錄電流，時程20ms。失活時間常數(shù)刺激程序：將測試電壓鉗制在60 m V，持續(xù)2s；然后復極到－100m V，時程10ms，緊接著從－60mV以10mV的階躍幅度刺激到+60mV，持續(xù)3 s，記錄電流。失活恢復時間常數(shù)刺激程序設置：鉗制電壓－80m V，復極到50mV使通道失活，然后將電壓從－30mV以10 m V階躍幅度刺激到－120 mV，持續(xù)3 s，記錄電流。去失活恢復時間常數(shù)刺激程序同失活恢復時間常數(shù)[3]。

1.3.4 Westernblot Westernblot分析藥物干預不同細胞模型前后蛋白表達情況。收集各個細胞模型對照組及實驗組細胞，加入預冷RIPA細胞裂解液。取細胞裂解上清液20 l，點樣于8%SDS-PAGE，電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。PVDF膜經(jīng)封閉液室溫封閉2h。一抗采用兔抗hERG多克隆抗體，以1∶400稀釋，4℃孵育過夜。二抗采用堿性磷酸酶標記的羊抗兔抗體，稀釋比為1∶800，室溫孵育2 h。BCIP/ NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒顯色。

1.4 統(tǒng)計方法采用Origin7.5軟件對原始數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、擬合和作圖。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩樣本行配對檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 PD-118057對WT-hERG和WT/E637K-hERG電流幅度及通道電流激活特性的影響

2 結果

2.1 PD-118057對WT-hERG和WT/ E637K-hERG電流幅度及通道電流激活特性的影響PD-118057干預前，WT/ E637K-hERG細胞Imax較WT-hERG低（=5.15，P＜0.05），WT/E637K-hERG細胞最大尾電流幅度（Itail）也較WT-hERG低（=4.13，＜0.05）。另外，PD-118057干預WT-hERG細胞后，其Imax（=3.71，P＜0.05）及Ita（il=4.56，P＜0.05）幅度明顯增大。而PD-118057干預WT/E637K-hERG細胞前后，其Imax（=1.23，P＞0.05）及Itai（l=0.88，P＞0.05）幅度都無顯著變化。PD-118057干預前后WT-hERG和WT/E637K-hERG通道V1/2、k無顯著變化（均P＞0.05）。而PD-118057干預E637K-hERG前后均沒有檢測到Ikr電流。見表1。

2.2 PD-118057對hERG通道電流失活特性的影響PD-118057干預WT-hERG后使得通道穩(wěn)態(tài)失活電流的電向明顯向負向移動（=6.45，P＜0.05），而斜率因子k無顯著變化（=2.17，P＞0.05）。而PD-118057干預WT/E637K-hERG前后V1/2和k都沒有顯著變化（=0.44、0.19，均P＞0.05）。見表2。

2.3 Western blot分析PD-118057干預hERG通道前后蛋白表達的變化WT-hERG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，在135和155kD可見兩條明顯的蛋白條帶，而轉(zhuǎn)染E637K-hERG的HEK293細胞僅在135kD可見蛋白條帶，而155kD的蛋白條帶缺失；轉(zhuǎn)染W(wǎng)T/E637K-hERG質(zhì)粒的HEK293細胞雖然在135和155 kD也有兩條蛋白條帶，但155 kD的蛋白條

帶明顯弱于野生型細胞。PD-118057干預后未能恢復WT/E637K-hERG及E637K-hERG通道蛋白表達。見封四彩圖3。

3 討論

2型長QT綜合征（LQT2）是由于hERG基因突變，導致其編碼的IK r通道電流減少，Q-T間期延長，引起心律失常，甚至猝死的發(fā)生[4]。目前對LQT2患者缺乏特異性診斷及有效治療方法。因此，尋求新的有效藥物至關重要。有文獻據(jù)報道，一些藥物能夠恢復蛋白轉(zhuǎn)運缺陷，但引起hERG通道阻滯，導致獲得性長QT綜合征的發(fā)生[5]。hERG通道已成為國外藥物安全篩查的標準。開發(fā)新型的具有有效藥物拯救而沒有hERG通道阻滯作用的化合物至關重要。PD-118057是一類經(jīng)典的hERG通道激活劑，對于治療LQT2具有極大的潛能，但其確切機制至今不詳。

本實驗結果顯示，PD-118057增大hERG電流幅度而不影響離子通道特性，與Zhou等[2]研究結果相符。目前，對于PD-118057作用機制有以下幾點猜測[5]：（1）通過快通道失活來減少hERG電流整流，從而減慢整個hERG通道失活；（2）通過阻礙電壓感受器與選擇性濾器之間相互作用，改變通道失活；（3）通過與hERG通道結合，將選擇性濾器穩(wěn)定在開放狀態(tài)從而導致Ikr電流增大。盡管目前的研究不能排除PD-118057是通過間接途徑增大hERG電流，但本實驗結果間接證明PD-118057直接作用于hERG通道，增加其通道的開放概率，從而使Ikr電流增大。另外，本實驗顯示PD-118057不能糾正負顯性機制E637K-hERG通道功能。PD-118057增大WT-hERG通道電流，但對WT/ E637K-hERG通道電流無顯著影響，這說明盡管WT/E637K-hERG是由WT-hERG和E637K-hERG隨機分布構成，但突變基因能夠影響正常基因的表達，使雜合型細胞通道功能低于野生型細胞，呈現(xiàn)負顯性效應。同時，本實驗Western blot結果與膜片鉗結果相符。正常的hERG通道生物過程包括最初由蛋白單體核心糖基化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成135kD未成熟蛋白，然后轉(zhuǎn)運至高爾基體，經(jīng)高爾基體復雜糖基化修飾后，運輸至細胞膜上形成的成熟通道蛋白，從而顯現(xiàn)兩條蛋白條帶（135、155kD）。且155kD被認為是糾正hERG通道蛋白轉(zhuǎn)運障礙的標志[6]。本實驗表明PD-118057不能恢復雜合型及突變型hERG通道的蛋白運輸缺陷。

對hERG鉀通道藥物基因組學研究對藥物的個體化使用及新藥研究具有重要意義。本實驗結果雖然不能直接應用于臨床，但為探索新的治療負顯性機制LQT2突變提供了實驗基礎，為開發(fā)新型的治療LQT2藥物提供新的思路及策略。另外，在后續(xù)實驗中，將進一步開展PD-118057的激動作用是否會被突變位點影響，及在動物、心肌細胞水平驗證PD-118057的安全性及治療價值。

表2 PD-118057對WT-hERG和WT/E637K-hERG通道電流失活特性的影響

[1]Perry M,Sachse FB,Abbruzzese J,etal.PD-118057 contacts the pore helix of hERG1 channels to attenuate inactivation and enhance K+conductance[J].Proc Natl Acad SciUSA,2009,106(47):20075-20080.

[2]Zhou J,Augelli-Szafran CE,Bradley JA, et al.Novel potent human ether-a-go-gorelated gene（hERG）potassium channel enhancersand their in vitro antiarrhythm ic activity[J].Mol Pharmacol,2005,68(3): 876-884.

[3]Anson BD,Ackerman MJ,Tester DJ,et al.Molecularand functional characterization of common polymorphism s in HERG（KCNH 2）potassium channels[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,286(6): H2434-2441.

[4]AbbottGW,SestiF,Splawski I,etal.MiRP1 forms IKrpotassium channelswithHERG and isassociatedwith cardiac arrhythmia[J]. Cell,1999,97(2):175-187.

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[6]Zhou Z,GongQ,January CT.Correction ofdefectiveprotein trafficking ofamutant HERG potassium channel in human long QT syndrome.Pharmacologicaland temperature effects[J].JBiolChem,1999,274 (44):31123-31126.

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.06.048

R54

A

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