miR21抑制劑對肺腺癌細胞A-549的抑制效果

姜學東，王 瓊，劉長浩，王國柱

miR21抑制劑對肺腺癌細胞A-549的抑制效果

姜學東，王 瓊，劉長浩，王國柱

目的探討miR21抑制劑轉染人肺腺癌細胞A-549對其體外侵襲及血管形成能力的影響。方法miR21抑制劑轉染A-549細胞，同時設置未轉染的A-549細胞作為對照組，轉染24、48、72及96 h后，四甲基偶唑氮法(MTT)法檢測兩組細胞增殖抑制率；Transwell方法檢測miR21抑制劑對A-549細胞侵襲的影響；小管形成實驗檢測miR21抑制劑對血管形成的影響。結果轉染24 h，兩組抑制率比較，差別無統計學意義；轉染48 h及以后，抑制劑組抑制率均高于對照組，差別有統計學意義(P<0.05)。Transwell檢測結果顯示miR21抑制劑組每個視野細胞數(11.60±5.32)個遠少于對照組(107.60±3.21)個，兩組差別有統計學意義(P<0.01)。抑制劑組每視野小管計數平均(159.30±0.51)個，遠少于對照組(508.80±1.30)個，兩組差別有統計學意義(P<0.01)。結論miR21抑制劑能夠明顯抑制A-549的侵襲能力，并能明顯抑制血管內皮細胞血管生成，提示miR21抑制劑可以作為潛在的肺癌基因治療的新方法。

miR21抑制劑；細胞侵襲；血管形成；肺腺癌

Micro RNA (miRNA) 是一類內源性非編碼小分子RNA，是人類基因組的主要調控因子。目前這些微小的細胞成分已進入到首選藥物的行列中[1,2]。特別是在癌癥中，某些miRNA本身就是非常有“誠意”的癌基因和腫瘤抑制基因，完全符合成為理想干預治療點的嚴格標準?！鞍┗蛞蕾嚒币辉~，過去專指蛋白質編碼的癌基因，本意是指癌癥細胞生存特異性地依賴某個激酶，因此對其抑制劑異常敏感，最近這個術語已延伸用于miRNA[3]。miRNA的治療功能是基于其天然的催化過程，1個既定的miRNA可以控制多種癌基因，并對癌癥中的致癌通路進行管制。正是由于miRNA具有這種能力，同時鑒于癌癥是一種不能通過針對單個基因而被成功治療的異質性疾病[4]，因此未來對miRNA的控制能力可能是治療成功與否的關鍵。miR21是人類細胞或組織中存在較為廣泛并且發現較早的miRNA，在人類miRNA的功能研究中發揮了不可替代的作用。既往研究發現，miR21在腫瘤的發生發展中充當了抗凋亡因子的角色[5]。

本研究通過轉染miR21抑制劑至肺腺癌細胞A549，觀察其對A549細胞體外侵襲及血管形成的影響，為肺腺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 由中國醫學科學院上海細胞生物研究所提供人肺腺癌細胞A-549、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，美國GIBCO 提供RPMI1640培養液，上海吉瑪提供miR21抑制劑，美國Corning提供Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Transwell小室、96孔板，美國BD提供Matrigel膠。

1.2 細胞培養和細胞轉染 無菌培養瓶中接種人肺腺癌細胞A-549和HUVEC細胞，加入含10%胎牛血清的適量PRMI-1640培養液，5%CO2的37 ℃培養箱中常規培養。用0.25%胰酶消化人肺腺癌細胞A549和HUVEC細胞，取對數期生長細胞，計數細胞后用miR21 抑制劑終濃度100 nM轉染A549細胞(抑制劑組)，同時設定未轉染的A549細胞作為對照組。

1.3 MTT檢測 取對數期生長期A549細胞于37 ℃培養液，無CO2條件下培養。調整細胞濃度為5×104/ml，按每孔200 μl接種于96孔板，各組設4個平行孔，每孔反應體系總體積為200 μl。在轉染細胞1、2、3、7、14 d時，每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml MTT，繼續培養4 h。吸去培養液后加入150 μl二甲基亞砜(DSMO)，在微量振蕩器振蕩10 min，室溫孵育30 min，檢測光密度值(OD)。凋零組OD值為不加細胞的空白凋零A490的OD值均數，各濃度組的OD值為平行孔的平均OD值。對照組OD值為空白對照組的平均OD值， miR21抑制劑抑制人肺腺癌細胞A549增殖的作用采用細胞增殖抑制率CI表示，計算公式如下：CI(% ) = (對照組-實驗組)OD/(對照組-凋零組)OD×100%。相同條件下實驗重復3 次。

1.4 侵襲實驗和小管形成試驗 用RPMI-1640培養液稀釋Matrigel，稀釋比例為1∶4。在Transwell上室中加入0.04 ml的Matrigel稀釋液，孵育1 h，使膠凝固，保持37 ℃。每組人肺腺癌細胞A-549用無血清培養液(含0.1% BSA)重新懸浮，調整細胞濃度為2.0×105/ml。上室加入0.01 ml細胞，下室加入0.5 ml含血清培養液，CO2培養2 d后，取出小室，用棉簽擦掉上膜細胞，小室以甲醇固定和結晶紫染色各15 min，然后鏡檢，每個濾膜取5個視野(×100)，計數取平均值并分析。測取96孔板-20 ℃預冷后，每孔用500 μl的Matrigel原液包被，搖動使之均勻分布于孔的各個部位并避免產生氣泡。保持溫度37 ℃，孵育1 h，使膠凝固。調整HUVEC細胞濃度至2.0×105/ml，每孔接種0.1 ml，繼續培養2 d后用顯微鏡觀察，取5個視野(×100)，取均值計數，照相分析。

2 結 果

2.1 MTT法實驗 轉染24 h，兩組抑制率比較，差別無統計學意義；轉染48 h及以后，抑制劑組抑制率均高于對照組，差別有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.2 侵襲實驗 抑制劑組每個視野細胞計數平均(11.60±5.32)個，對照組(107.60±3.21)個；與對照組相比，抑制劑組穿過基質膠的細胞數量明顯少于對照組(圖1)，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 小管形成試驗 抑制劑組每視野小管計數平均(159.30±0.51)個，對照組(508.80±1.30)個，抑制劑組與對照組比較，能明顯抑制血管形成(P<0.01，圖2)。

3 討 論

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤，發病率逐年上升，其中肺腺癌約占50%，對人們健康危害極大[6]。藥物基因組學和分子生物學的迅速發展，使得肺癌的個體化治療在臨床實踐中得到運用，基因治療作為一種特異高效的強治療方法，越來越受到人們重視。近年來，隨著分子生物學和分子遺傳學理論和技術的發展，以及人們對肺癌發病機制的了解日益深化，說明了很多基因可作為肺癌基因治療的有效靶基因。

近年來，miRNA在多種生物體中的存在不斷得到證實。研究者用生物信息學、基因表達和克隆等方法發現了大量未知miRNAs，并將這些miRNAs歸類編號[7]。miR21位于17q23.2染色體FRA17B脆性區域上，是具有自主轉錄單位的一種miRNA[8]。研究表明，miRNA有致癌作用，在多種腫瘤細胞中miR21的表達均顯著異常，參與調控多種抑癌基因的表達。研究發現，在神經膠質瘤細胞中，miR21的表達升高，抑制miR21 能促進細胞凋亡，致使凋亡相關蛋白酶活性升高，使神經膠質瘤細胞生存能力顯著降低[9]。研究表明，miR21作為介入治療的靶標，抑制miR21可上調TMP1、PDCD4和maspin的表達，減少乳腺癌MDA-MB-231細胞轉移與侵入肺部[10]。抑制miR21可以作為晚期癌癥防治的一種新的治療措施。

本研究中，MTT實驗顯示，導入miR21抑制劑能夠明顯抑制肺腺癌細胞A549；侵襲實驗結果顯示，導入miR21抑制劑的肺腺癌細胞A549較未導入的A549細胞，增殖明顯被抑制；同樣，導入miR21抑制劑的穿膜細胞數明顯少于未導入miR21抑制劑的A549細胞。小管形成實驗結果顯示，導入miR21抑制劑的HUEC細胞形成血管的細胞數明顯少于未導入miR21抑制劑的HUVEC細胞。

綜上所述， miR21抑制劑轉染肺腺癌細胞A549后增殖可明顯被抑制，同時miR21抑制劑轉染的HUVEC細胞能夠明顯抑制內皮細胞血管形成能力，以及細胞的侵襲活性。由此表明，miR21可能通過抑制腫瘤組織內血管的生成能力及肺癌細胞的侵襲能力，從而抑制肺癌的發生發展過程，這將為肺腺癌基因治療研究提供新的試驗依據和理論基礎。

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(2014-01-21收稿 2014-02-07修回)

(責任編輯 武建虎)

InhibitionofmiR21inhibitoronA-549cellsinvitro

JIANG Xuedong, WANG Qiong, LIU Changhao, and WANG Guozhu. Department of Thoracic Cardiovascular Surgery, Liaoning Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Shenyang 110034, China

ObjectiveTo study the inhibition of miR21 inhibitor on the invasion and anti-angiogenesis of A-549 cells.MethodsMiR21 inhibitor was transfected into A-549, and the control group was set up. 24, 48, 72, 96 hours after transfection, the effect of growth suppressing was quantified by 3-2(4，5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay, anti-invasion was observed by transwell assay. Tube formation assay was used to detect the effects of miR21 inhibitor on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) angiogenesis.ResultsTwenty-four hours after transfection, the suppressing rate was different between the two groups; 48, 72, 96 h after transfection, the suppressing rates in inhibition group were higher than those in control group, the difference was statistically significant(P<0.05). By transwell assay, number of cells in inhibition group (11.60±5.32) was less than that in control group (107.60±3.21), the difference was statistically significant(P<0.01). Tubes in inhibition group (159.30±0.51) was less than that in control group (508.80±1.30), the difference was statistically significant(P<0.01).ConclusionsmiR21 inhibitor can inhibit the invasion of A-549 and angiogenesis of HUVEC. miR21 inhibitor can be a potential gene-therapy for gastric carcinoma.

miRNA21 inhibitor; invasion; angiogenesis; lung adenocarcinoma

姜學東，碩士，副主任醫師，E-mail: jiangxd08@sina.com

110034沈陽，武警遼寧總隊醫院胸外科

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