新疆石河子地區(qū)部分規(guī)模化豬場豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

韓太武 楊 超 趙春光 （新疆石河子市獸醫(yī)衛(wèi)生檢疫所 832000）

豬多殺性巴氏桿菌是豬呼吸道綜合征的重要原發(fā)感染菌[1]，有兩種常見的豬傳染病是由多殺性巴氏桿菌引起的，即豬傳染性胸膜肺炎和豬肺疫[2]。其可導致大批豬迅速死亡，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了非常大的經(jīng)濟損失，根據(jù)菌株間抗原成分的差異，多殺性巴氏桿菌可分為多個血清型。用被動血凝試驗對莢膜抗原分類，該菌可分為A、B、C、D、E、F共5個血清型;用凝集反應對菌體抗原分類可分為12個血清型；用瓊脂擴散試驗對熱浸出菌體抗原分類，本菌可分為16個血清型[3]。

該病一年四季均可發(fā)生，多在春夏呈爆發(fā)[1]。多呈散發(fā)性，但有時豬可呈地方流行性，最急性型，全身黏膜、漿膜和皮下組織有出血點，全身淋巴結(jié)輕度腫脹、出血、切面深紅[4]；心外膜和心包膜有出血點；肺急性水腫，呈紅白相間的大理石樣花紋；脾有出血，但無腫大；皮膚有紅斑。急性型，特征性的病理變化為纖維素性肺炎，肺有不同程度的肝變區(qū)，周圍常伴有水腫和氣腫，病程長的肝變區(qū)內(nèi)有壞死灶，肺小葉間漿液浸潤，切面呈大理石樣紋理；胸膜常有纖維素性附著物，嚴重的胸膜與病肺粘連；胸腔及心包積液。胸腔淋巴結(jié)腫脹，面發(fā)紅，多汁；支氣管、氣管內(nèi)含有多量泡沫狀黏液，黏膜發(fā)炎。慢性型，以慢性肺炎變化為主。肺肝變區(qū)擴大并有黃色或灰色壞死灶，外面有結(jié)締組織包裹，內(nèi)含干酪樣物質(zhì)，有的形成空洞并與支氣管相同；心包與胸腔積液，胸腔有纖維素性沉著，肋膜肥厚，常與病肺粘連。

多殺性巴氏桿菌是規(guī)模化豬場的一類重要病菌，嚴重影響豬群健康[5]，在防制方面，首先應注意飼養(yǎng)管理，消除可能降低抵抗力的應激因素，其次應盡可能避免病原侵入，并對圈舍、飼槽、飲水器具定期進行消毒，豬舍內(nèi)外用2%燒堿徹底消毒[6]。同時定期進行預防接種，增強機體對本病的特異性免疫力。發(fā)生本病時，應將患病動物隔離，及早確診，及時治療。

目前常用的疫苗是以滅火苗和弱毒苗為主，豬肺疫的預防可用豬肺疫口服弱毒苗，豬肺疫氫氧化鋁滅火苗、豬瘟-豬丹毒-豬肺疫三聯(lián)活疫苗，豬丹毒-豬肺疫氫氧化鋁二聯(lián)滅活苗這四種疫苗免疫期均在半年以上。多殺性巴氏桿菌分布廣泛、血清型較多，不同地區(qū)的菌種差異明顯，導致免疫效果不理想[3]。因而研究的疫苗還不能對多種血清型的菌株引起的疾病都起預防作用，研發(fā)針對多種血清型的疫苗是今后研究的方向[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料采自新疆石河子地區(qū)部分規(guī)模化豬場送檢的因呼吸道引起死亡的豬或瀕死豬，無菌采集其肺臟，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基和菌株 普通瓊脂培養(yǎng)基、5%兔鮮血培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、LB肉湯、生化鑒定培養(yǎng)基(均石河子大學實驗室提供)。

1.1.3 菌株及血液 兔血采自新疆石河子大學動物醫(yī)院。

1.1.4 主要儀器 CX21FS1生物顯微鏡、ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器、HDX-9162mBE電熱恒溫培養(yǎng)箱、單人雙面超凈工作臺、高速冷凍離心機、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋等。

1.1.5 試驗動物 25日齡左右的小白鼠8只(均購于新疆石河子動物養(yǎng)殖中心)。

1.1.6 藥敏紙片 購于北京華美生物技術(shù)有限公司。

1.1.7 主要培養(yǎng)基的配制 TSA和TSB培養(yǎng)基按照相應說明書進行配制，121℃高壓滅菌20min后，室溫保存?zhèn)溆谩Ｅ囵B(yǎng)豬多殺性巴氏桿菌用的TSA在傾注平板前加入5%～10%犢牛血清，TSB待冷卻后加入5%～10%犢牛血清。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定 （1）Pm的分離培養(yǎng)：將無菌采集的疑似豬多殺性巴氏桿菌感染的病變的肺臟，分別無菌接種到TSB(含5%犢牛血清)培養(yǎng)基上，置37℃增菌培養(yǎng)24h后，接種于腦心浸液鮮血瓊脂平板和麥康凱平板，37℃培養(yǎng)24h，觀察細菌生長情況、菌落形態(tài)以及是否溶血，挑選單個菌落無菌接種到TSA(含5%犢牛血清)培養(yǎng)基上進一步鑒定。（2）細菌培養(yǎng)：將純化好的細菌劃線接種TSA平板，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板，然后分別轉(zhuǎn)接葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、鼠李糖等碳源生化鑒定管以及吲哚VP、mR硝酸鹽還原生化鑒定管進行生化反應。

1.2.2 藥物敏感試驗 將已經(jīng)純化好的Pm，挑取單個菌落接種到腦心浸液培養(yǎng)基，經(jīng)過37℃培養(yǎng)14h后，采用比濁管進行比濁計數(shù)，后將已經(jīng)鑒定好的Pm菌株用滅菌的棉拭子均勻涂到到TSA(含5%血清)平板上，然后做藥敏試驗，貼上標準藥敏試紙，經(jīng)過37℃培養(yǎng)18h后，通過測量藥物紙片在平板中產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小來的標準來判斷菌株對藥物的敏感程度，每個藥敏紙片做3個，結(jié)果取其算術(shù)平均值。

1.2.3 動物致病試驗 將以上分離的所有細菌挑選4菌株接種到TSA（含5%血清)培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)18～24h后，將試驗的所有公鼠均勻分為5組，每組選擇4個精神狀況相似的、個體大小相近的小鼠作為感染實驗對象，每株注射4只，最后一組為對照組，試驗組每只小鼠腹腔注射菌液0.3ml，對照組腹腔注射相同體積的LB肉湯，隔離例養(yǎng)并觀察小鼠的征狀，對發(fā)病或死亡的小鼠進行剖解，采取病變部位進行細菌分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離鑒定及部分生物學特性

2.1.1 細菌的培養(yǎng)特性及形態(tài) 病料接入TSA(含5%犢牛血清)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)14h后，有藍色熒光，菌落潤滑，似水珠狀的菌株，分離菌在普通瓊脂上生長緩慢，24h后才出現(xiàn)零星的菌株，在麥康凱瓊脂上不生長。在腦心浸液鮮血瓊脂平板上培養(yǎng)24h后，出現(xiàn)灰白色、光滑濕潤、邊緣整齊的水滴樣小菌落，無溶血現(xiàn)象，同時挑取單個的菌落進行涂片鏡檢，從顯微鏡可以看出兩級著色的桿菌，初步診斷多Pm菌。

2.1.2 細菌的生化特性 多殺性巴氏桿菌的判定標準為：麥康凱培養(yǎng)基上不能生長，分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、果糖、甘露醇產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵麥芽糖、乳糖、鼠李糖，吲哚、硝酸鹽還原試驗陽性，mR、VP試驗陰性，本次生化結(jié)果共分離出Pm菌共12株，主要從病豬的肺臟上分離出。

表1 生化試驗結(jié)果

2.2 細菌藥敏試驗結(jié)果

從藥敏結(jié)果可以看出：從新疆石河子地區(qū)部分規(guī)模化豬場豬豬多殺性巴氏桿菌對先鋒VI、氯霉素、環(huán)丙沙星敏感性較強，其耐藥率分別為83.3%、75%、75%，而該菌對其他幾種抗生素耐藥率較強，該菌對四環(huán)素的耐藥率為66.7%。

表2 12種抗生素對12株豬多殺性巴氏桿菌抑制作用

圖 12種抗生素對12株傳染性胸膜肺炎放線桿菌抑制作用

2.3 動物接種試驗結(jié)果

經(jīng)過對其中4株P(guān)m菌的致病力進行動物接種試驗可知小鼠的死亡情況見表3，XNC01、XNC02、XNC03、XNC04四株菌的致死率分別為25%、100%、100%、75%，同時將死亡的小鼠肺組織接種到TSA(含5%血清)培養(yǎng)基平板上可見有藍色熒光，菌落潤滑，似水珠狀的菌株，經(jīng)過涂片鏡檢可以看出兩極著色的球桿菌。

表3 Pm菌致病力試驗

3 討論

3.1 Pm生物學特性

根據(jù)發(fā)病豬群的流行病學特征、臨床征狀、實驗室檢驗結(jié)果，綜合鑒定此分離菌為豬多殺性巴氏桿菌。同時可以得知，該菌對人工培養(yǎng)基具有選擇性，分離菌在普通瓊脂上生長緩慢，24h后才出現(xiàn)零星的菌株，在麥康凱瓊脂上不生長，但是在TSA(含5%犢牛血清)培養(yǎng)基上生長旺盛，動物試驗表明，此分離菌對小白鼠有很強的致病性各菌株直接有差異，而且差異顯著，表明不同的菌株致病力不同，主要跟豬多殺性巴氏桿菌的血清型有很 大的關(guān)系。

3.2 Pm耐藥性分析

分離到的豬多殺性巴氏桿菌對先鋒Ⅵ，環(huán)丙沙星，氯霉素敏感性較強，其耐藥率分別為83.3%、75%、75%，而該菌對其他的抗生素耐藥性較強，其中四環(huán)素對該細菌的耐藥率達到了66.7%。由于氯霉素目前為國家禁用的藥物，所以建議臨床上選擇其他兩種藥物，對其他紅霉素等9種藥物不敏感。由此可以證明豬多殺性巴氏桿菌極易產(chǎn)生耐藥而且以多重耐藥為主，這可能與不科學的藥物使用有很大的關(guān)系，同時現(xiàn)在抗生素品種不斷更新，使分離的菌株耐藥性不斷上升，因此，對動物的治療應根據(jù)致病菌株的特性，藥敏試驗，科學合理的使用抗生素。

3.3 Pm致病力分析

從病豬分離出其中4株豬多殺性巴氏桿菌XNC01、XNC02、XNC03、XNC04四株菌的致死率分別為25%、100%、100%、75%，從結(jié)果可以看出4株之間差異明顯，表明各個豬場豬多殺性巴氏桿菌的血清型有一定的差異，也可能與小鼠體質(zhì)有關(guān)，所以對該病的防治應從跟治療，找到導致本病發(fā)生的直接根源，加強環(huán)境的消毒，提高豬群的抵抗力，控制好豬瘟、口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征、圓環(huán)等病毒性疾病防止本病的繼發(fā)感染。

[1]魏世安.豬多殺性巴氏桿菌的診斷技術(shù)[J].獸醫(yī)導刊, 2011(51).

[2]徐引第.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定和藥敏試驗[J].中國獸藥雜志，2011(5): 5-7.

[3]李浩，劉陽.多殺性巴氏桿菌病研究進展[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2011(2): 31-32.

[4]扎西才旦.豬多殺性巴氏桿菌病的診斷與防治[J].中國獸醫(yī)藥雜志，2005(5): 52-53.

[5]桂文龍，胡新崗.蘇中地區(qū)豬源多殺性巴氏桿菌的分子流行病學調(diào)查[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2013(4): 23-24.

[6]朱鳳瓊，孟志宏.豬多殺性巴氏桿菌病的診治[J].云南畜牧獸醫(yī)，2004(2): 43.

[7]謝波.多殺性巴氏桿菌抗原的研究進展[J].韶關(guān)學院學報.自然科學，2010(3): 91-93.