生物發(fā)酵法處理病死雞微生物含量變化的追蹤監(jiān)測

王苗利 陳 靜 田夫林 王貴升 孫圣福 馬慧玲 李玉杰 徐 鴻 尹斐斐 劉麗平 徐 聰 王世榮

（山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 山東 濟(jì)南 250022）

目前國內(nèi)的肉雞和蛋雞生產(chǎn)正在由原來的小型、分散型經(jīng)營向中大企業(yè)經(jīng)營方向發(fā)展，在生產(chǎn)大量雞肉、雞蛋的同時(shí)，還產(chǎn)生大量雞糞、廢水、死亡雞等廢棄物，如對(duì)其處理不當(dāng)，任意傾倒、排放或堆積，將對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染[1]。被丟棄的病畜禽尸體其所帶的細(xì)菌、病毒會(huì)隨空氣或其他途徑迅速傳播擴(kuò)散，如果是重大動(dòng)物疫病或人畜共患病，會(huì)造成重大動(dòng)物疫情或人畜共患病發(fā)生，人畜生命安全就會(huì)受到威脅，經(jīng)濟(jì)就會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p失，影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。病死畜禽的無害化處理是消滅傳染源最有效和最徹底的措施，特別是當(dāng)前正值重大動(dòng)物疫病防控的重要階段和食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全水平全面提升的關(guān)鍵時(shí)期[3]。

對(duì)病死畜禽處理的基本原則是防止有害病原微生物的擴(kuò)散與傳播。目前，比較常用的處理方法包括深埋、焚燒、工業(yè)油脂提煉和好氧發(fā)酵等[4-6]。比較了病死畜禽無害化處理的幾種方式的特點(diǎn)，深埋雖然操作方便，但深埋處理一般是針對(duì)無機(jī)物含量高于60%的廢棄物，而病死畜禽主要以有機(jī)物為主，直接填埋會(huì)造成有機(jī)物資源浪費(fèi)，還會(huì)帶來二次污染[7]；焚燒處理的減量化、無害化最徹底，但由于其高昂的設(shè)備投資成本及二惡英污染而限制了焚燒廠的建立[8]；工業(yè)油脂提煉法因油脂提煉病死畜禽的生物安全性不高，現(xiàn)在很多國家已經(jīng)限制利用病死畜禽進(jìn)行油脂加工提煉[9]；對(duì)于病死畜禽好氧發(fā)酵的處理方式，美國一項(xiàng)針對(duì)專業(yè)人士的調(diào)查顯示[10]，51%認(rèn)為該方式性價(jià)比較高，46%認(rèn)為它可以提高生物安全性，68%認(rèn)為容易操作，44%認(rèn)為效果比預(yù)期還好， 只有0.6%認(rèn)為它不成功。可見，在美國以好氧發(fā)酵處理病死畜禽的方式已獲得了較好地評(píng)價(jià)。綜合比較這幾種處理方式，好氧發(fā)酵法可以同時(shí)達(dá)到廉價(jià)和無害化處理的要求，符合環(huán)境保護(hù)與資源再生的理念，是病死畜禽無害化處理的主要發(fā)展方向。

生物發(fā)酵法處理病死畜禽后，發(fā)酵堆殘余的病原微生物數(shù)量、種類有何變化尚未有具體的追蹤研究，因此，目前，對(duì)生物發(fā)酵法無害化處理病死畜禽技術(shù)進(jìn)行效果追蹤監(jiān)測及評(píng)估勢(shì)在必行。

1 材料與方法

1.1 材料

PCA細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(GB)、熒光RT-PCR/ RT-PCR檢測試劑盒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 本次試驗(yàn)共對(duì)3組堆體的樣品進(jìn)行采集，分別為A組、B組、C組，結(jié)合生產(chǎn)操作，于埋入病死雞前0、7、14、21d分別取樣，取樣位置按照堆體對(duì)角線布置5 個(gè)點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)分表層3～5cm、中心20～30cm、深部40～50cm進(jìn)行取樣，每個(gè)樣品200g左右，塑料袋密封。本試驗(yàn)每組每次各采集15份樣品，每層采集了5份樣品，共采集了180份樣品。為了更好的追蹤發(fā)酵堆微生物的變化情況，對(duì)A組一直追蹤采樣到第35d，每次采集15份樣品，每層采集了5份樣品。在病死雞埋入前樣品的采集，遵循操作安全、無菌，采樣由小到大、病變與健康組織兼顧的原則。脾、腎、淋巴結(jié)可以采取完整的一個(gè)。肝、肺等可以采集病變和健康組織交界處，至少5×5cm大小。腸或氣管，采集帶病變部位至少5cm長。

1.2.2 病毒檢測 對(duì)采集的樣品經(jīng)過常規(guī)處理后，進(jìn)行病毒檢測。檢測的病毒種類、檢測方法和鑒定方法見表1。

表1 病毒檢測種類、檢測和鑒定方法

1.2.3 細(xì)菌計(jì)數(shù) （1）對(duì)采集的樣品進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，方法按照GB/T4789.28-2003進(jìn)行。樣品的稀釋：稱取25g樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000～10000r/min均質(zhì)1～2min，制成1:10的樣品勻液；用1ml無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1ml，沿管壁緩慢注于盛有9ml稀釋液的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。依次進(jìn)行制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1次1ml無菌吸管或吸頭；根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1ml樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1ml空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照；及時(shí)將15～20ml冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于46±1℃恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。（2）培養(yǎng)：待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36±1℃培養(yǎng)48±2h。菌落計(jì)數(shù)：可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位(colony-forming units，CFU)表示。

2 結(jié)果

2.1 熒光RT-PCR/ RT-PCR檢測樣品中病毒

生物發(fā)酵法無害化處理病死雞對(duì)病毒的殺滅情況檢測結(jié)果，見表2。

表2 不同時(shí)間A、B、C組病毒檢測結(jié)果

2.2 細(xì)菌數(shù)

通過細(xì)菌計(jì)數(shù)可知，制堆前A、B、C組樣品CFU/g分別為5.34×1008、4.26×1010、3.57×1011，制堆后兩組樣品第7、14、21d的樣品CFU結(jié)果見表3，A組第28d、35d的CFU結(jié)果見表4。

表3 A、B、C組第7、14、21d平板計(jì)數(shù)結(jié)果 （CFU/g）

表4 A組第28d、35d平板計(jì)數(shù)結(jié)果 （CFU/g）

3 討論

（1）生物發(fā)酵法處理病死雞因其眾多的優(yōu)點(diǎn)受到國內(nèi)外廣大養(yǎng)殖戶喜愛，如操作簡單、不產(chǎn)生廢氣，對(duì)環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際應(yīng)用過程中也存在一些不足的地方，例如要人工測量溫度、濕度，及時(shí)控制發(fā)酵堆體的濕度、溫度，以保證發(fā)酵效果。另外，如何進(jìn)一步提高生物發(fā)酵無害化處理病死雞的微生物殺滅效果，并進(jìn)行推廣，有待于進(jìn)一步研究。（2）由表2可知，僅在B組檢出的傳染性支氣管炎病毒在經(jīng)過21d的發(fā)酵后被殺滅。由表3可知，三組無害化處理堆經(jīng)過21d的處理后，三組菌體含量均下降明顯，含量的數(shù)量級(jí)非常一致，均達(dá)到6個(gè)數(shù)量級(jí)。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)可知，lg肥沃土壤，如菜園土中常可含有108個(gè)甚至更多的微生物，而在貧瘠土壤如生荒土中僅有103～107個(gè)微生物。因此，此生物發(fā)酵法無害化處理病死雞后，其微生物含量已僅僅相當(dāng)于荒土等貧瘠土壤的微生物含量。由表4可知，由A組的后續(xù)跟蹤實(shí)驗(yàn)可知，發(fā)酵堆在第21天的CFU最低，第28天和35天采集的樣品CFU數(shù)量逐漸升高，因此，理論上此生物發(fā)酵法的發(fā)酵時(shí)間設(shè)計(jì)到第21天是微生物含量最少的發(fā)酵時(shí)間。

綜上所述，說明采用此無害化方法處理病死雞，其殺滅微生物的效果非常顯著，并且發(fā)酵時(shí)間設(shè)計(jì)到21d，微生物含量最低。

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