奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

王妍慧 （山東省萊陽(yáng)市畜牧獸醫(yī)站 265200） 孫 禮 （山東省萊陽(yáng)市畜牧獸醫(yī)局）

乳房炎是奶牛的常發(fā)病、多發(fā)病，是造成奶牛業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)損失的重要因素之一。目前我國(guó)奶牛乳房炎發(fā)病率高達(dá)70%～80%[1]。導(dǎo)致奶牛乳房炎的因素很多，但病原微生物是導(dǎo)致乳房炎的主要病因。目前已報(bào)道的奶牛乳房炎病原菌主要以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主，約占90%以上[2]。但由于這些病原菌與環(huán)境和管理關(guān)系密切，因此各個(gè)地區(qū)與不同奶牛群的感染情況各不相同，優(yōu)勢(shì)菌因養(yǎng)殖區(qū)域、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件、奶牛個(gè)體差異的不同而不同[3,4]。無(wú)論是何種病原微生物引起的乳房炎，都應(yīng)首先查明病因，再進(jìn)行治療，不可盲目地亂用抗生素，否則造成病情的加重和不必要的奶源污染[5]。我國(guó)不少學(xué)者對(duì)不同地區(qū)奶牛場(chǎng)的乳房炎進(jìn)行了細(xì)菌分離與藥敏試驗(yàn)，對(duì)該病的防治起到積極作用[9]。本研究對(duì)實(shí)際生產(chǎn)中一奶牛乳房炎病例進(jìn)行病原菌的分離鑒定與藥物敏感性試驗(yàn)，旨在為臨床奶牛乳房炎的治療提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢乳樣 樣品采自山東省萊陽(yáng)市某奶牛場(chǎng)3頭臨床乳房炎病牛的新鮮奶樣。奶牛按常規(guī)擠奶消毒程序，先用溫水沖洗乳房，然后用0.1%新潔爾滅清毒，最后用75%酒精消毒乳頭。每個(gè)乳頭棄去前3～4把奶，然后以無(wú)菌操作，每個(gè)乳室取奶樣約10ml于滅菌小瓶中，加蓋封緊，標(biāo)號(hào)，置于附有冰袋的采樣箱內(nèi)，立即送檢。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 （1）培養(yǎng)基主要有普通瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂、普通營(yíng)養(yǎng)肉湯、甘露醇高鹽瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基、改良德華瓊脂培養(yǎng)基等。（2）生化試劑主要有糖生化發(fā)酵管、mR試劑、V-P試劑、吲哚試劑、尿素酶、枸櫞酸鹽、馬尿酸鹽、七葉苷等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 取各乳房炎奶牛的乳樣10ml，加入滅菌離心管中做好標(biāo)記，以2000r/min離心15min，棄去管中上層液體，留取底部沉淀物。將沉淀物分別劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、鮮血瓊脂、麥康凱瓊脂及伊紅美藍(lán)瓊脂平板，置溫箱37℃培養(yǎng)24h后，觀察菌落形態(tài)特征，并選取形態(tài)不同的菌落涂片、革蘭染色、鏡檢，根據(jù)菌體形態(tài)及染色特性初步判定細(xì)菌種類(lèi)，并將其分別進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 生化試驗(yàn) 將分離純培養(yǎng)的細(xì)菌分別做生化鑒定試驗(yàn)，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第8版)判定細(xì)菌種類(lèi)。例如：對(duì)疑似葡萄球菌做生化鑒定，包括觸酶試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)及甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)等；對(duì)疑似鏈球菌做生化鑒定，包括觸酶試驗(yàn)、CAmP試驗(yàn)、馬尿酸鈉水解試 驗(yàn)、甘露醇和七葉苷發(fā)酵試驗(yàn)等。

1.2.3 藥物敏感試驗(yàn) 選取青霉素、氨芐西林、先鋒霉素V、頭孢喹諾、頭孢氨芐、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考、慶大霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、丁胺卡那霉素、左氧氟沙星12種抗生素采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。用吸管滴加純培養(yǎng)菌液1滴(約0.02ml)于固體培養(yǎng)基平板上，用涂布器將菌液均勻涂布，加蓋后放置10 min左右，待平板面稍干，用鑷子將藥敏紙片平放在瓊脂平板上。貼好紙片的平板，置37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑。直徑小于10mm為耐藥，10～15mm之間為中度敏感，大于15mm為高度敏感[6-8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌

奶樣劃線37℃培養(yǎng)24h后，在血瓊脂平板上形成兩種菌落。一種菌落周?chē)尸F(xiàn)完全透明的溶血環(huán)，革蘭染色陽(yáng)性球菌，無(wú)芽孢、無(wú)莢膜、排列呈不規(guī)則的葡萄狀，單個(gè)、成雙或成鏈狀排列，初步判定為金黃色葡萄球菌(編號(hào)A菌)；另一種菌落在血瓊脂平板上呈圓形，表面光滑濕潤(rùn)，透明或半透明。周?chē)尸F(xiàn)完全透明的溶血環(huán)，革蘭染色陽(yáng)性球菌，呈球形或卵圓形，多為鏈狀排列，初步判定為鏈球菌(編號(hào)B菌)。A菌在卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，產(chǎn)生濕潤(rùn)、光滑、隆起的黃色圓形菌落，直徑2mm左右；B菌在改良德華瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，產(chǎn)生的菌落較小，呈針尖大小，灰白色，表面光滑。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

將分離到的2個(gè)株細(xì)菌純培養(yǎng)后進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定，結(jié)果如表1。

表1 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)培養(yǎng)特點(diǎn)、菌落形態(tài)、革蘭氏染色等特性及生化試驗(yàn)結(jié)果，判定所分離的細(xì)菌中A為葡萄球菌菌，B為無(wú)乳鏈球菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離的兩種病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，金黃色葡萄球菌對(duì)頭孢喹諾、頭孢氨芐、左諾氟沙星、氨芐西林、強(qiáng)力霉素高度敏感；無(wú)乳鏈球菌對(duì)頭孢喹諾、頭孢氨芐、左氧氟沙星高度敏感。也可以看出，引起本例乳房炎的主要病原菌對(duì)青霉素、先鋒霉素V、氨芐西林等抗生素有了很強(qiáng)的耐藥性。

表2 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果(抑菌圈直徑) (mm)

2.4 臨床治療

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選用頭孢喹諾、頭孢氨芐、左氧氟沙星對(duì)每個(gè)感染乳區(qū)進(jìn)行乳房灌注，輪換用藥，劑量參照藥品說(shuō)明書(shū)。經(jīng)敏感藥物治療5d后，3頭奶牛乳房炎癥狀明顯減輕，10d后痊愈。

3 討論

3.1 致病菌種類(lèi)

從病原菌的分離鑒定結(jié)果來(lái)看，引起本例牛乳房炎的主要是金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌。金黃色葡萄球菌和鏈球菌屬于傳染性的病原體，且由相關(guān)資料表明，由該兩類(lèi)細(xì)菌感染引發(fā)的乳房炎達(dá)90%以上，在平時(shí)的飼養(yǎng)以及擠奶過(guò)程中的牛體的衛(wèi)生消毒等環(huán)節(jié)的衛(wèi)生不徹底，可能會(huì)導(dǎo)致奶牛感染病原菌而致病[6]。因此日常的飼養(yǎng)管理中，搞好環(huán)境衛(wèi)生、注意清潔消毒對(duì)于預(yù)防和減少奶牛乳房炎的發(fā)生有重要的意義[7]。

3.2 抗菌藥物的選擇

抗生素作為治療藥物在奶牛乳房炎的控制中起了重要作用，但長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌大量滋生，使得常用的抗菌藥物很難再發(fā)揮巨大的殺菌作用。從試驗(yàn)結(jié)果可知，引起本例牛乳房炎的兩種主要病原菌對(duì)對(duì)青霉素、先鋒霉素V、氨芐西林等抗生素均存在不同程度的耐藥現(xiàn)象，尤其是青霉素類(lèi)藥物，產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性，這與奶牛場(chǎng)長(zhǎng)期將青霉素類(lèi)藥物用于干乳期封閉乳頭有關(guān)。若在臨床上繼續(xù)使用青霉素類(lèi)藥物來(lái)治療該病，將不能得到有效的控制，故應(yīng)轉(zhuǎn)而選用藥物敏感性較高的藥物，如頭孢喹諾、頭孢氨芐、左氧氟沙星等。

4 結(jié)論

奶牛乳房炎的發(fā)生，是病原、機(jī)體防衛(wèi)功能、外界環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，所以加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，增強(qiáng)奶牛體質(zhì)，注意環(huán)境衛(wèi)生和擠奶衛(wèi)生是預(yù)防乳房炎的重要措施。抗生素的廣泛應(yīng)用，菌株耐藥增強(qiáng)，這不僅給乳房炎的有效防治帶來(lái)障礙，而且還會(huì)給人類(lèi)健康帶來(lái)不利。因此，乳房炎治療用藥應(yīng)在病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上確定，避免濫用抗生素。

[1]金爾光, 曾新華, 周木清等.奶牛乳房炎研究概況[J].養(yǎng)殖與飼料, 2008,(6): 69.

[2]周利青.奶牛乳房炎的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息, 2005(5): 8-9.

[3]K.Persson Waller、Host Resistantto, mastitis [J].Ruminant ysiology, 2000, 44(26): 449.

[4]倪語(yǔ)星, 洪秀華.細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)與抗感染治療[m].北京: 人民軍醫(yī)出版社, 2002.

[5]東秀珠, 蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[m].北京: 科學(xué)出版社, 2001.

[6]Patrick B,Peter K,Daniela H,et al.methods for identification of staphylococcus aureusisolates in cases of bovine mastitis [J].Clin microbiol,2003,767-771.

[7]路建彪, 劉文強(qiáng).奶牛乳房炎病原菌的分離與鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2007, 43(1): 62.