飼用轉(zhuǎn)基因豆粕對牛奶營養(yǎng)成分的影響及奶中外源基因轉(zhuǎn)移檢測

史雪萍 畢慧娟 周 茜 劉 斌 王述柏

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 山東 青島 266109）

近年來我國大豆進口總量迅速增長，進口品種主要為轉(zhuǎn)基因大豆。雖然我國還沒有批準(zhǔn)任何轉(zhuǎn)基因大豆品系進行商業(yè)化種植，但我國已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因大豆的使用與消費大國[1]。飼料安全是動物源性食品安全的重要影響因素，隨著轉(zhuǎn)基因飼料的廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因飼料安全成為飼料質(zhì)量安全的重要組成部分[2]。轉(zhuǎn)基因飼料外源基因在動物體內(nèi)如何代謝是很多學(xué)者關(guān)注的問題，對飼用轉(zhuǎn)基因飼料畜禽的產(chǎn)品質(zhì)量及外源基因轉(zhuǎn)移檢測是評價轉(zhuǎn)基因飼料飼用安全性的檢測指標(biāo)之一。本試驗隨機選擇7個奶牛場，檢測精料外源基因種類并分析其營養(yǎng)成分，同時檢測了牛奶中的主要營養(yǎng)成分，旨在為轉(zhuǎn)基因飼料安全性評價體系的建立提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料 隨機選擇青島周邊7個奶牛場，每個牛場采集奶牛精料4份，牛奶樣品5份(取自5頭牛)，牛場分別編號為1、2、3、4、5、6、7。

1.2 主要儀器設(shè)備 臺式離心機(Eppendorf 5810R, Germany)、實時熒光定量PCR儀(master cycle realplex4, Eppendorf, 德國)、微量移液器(Eppendorf Research，Eppendorf, 德國)、分光光度計(BioPhotometer plus, Eppendorf, 德國)、KDN-120C凱氏定氮儀(上海纖檢儀器有限公司)等。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 奶牛精料和牛奶營養(yǎng)成分含量測定 主要檢測奶牛精料中的水分、粗蛋白、粗纖維、粗灰分、鈣和總磷含量，水分的測定參照GB6435-86，粗蛋白質(zhì)的測定參照GB6432-1994，粗脂肪的測定參照GB6433-2006，粗纖維的測定參照GB/T6434-2006，粗灰分的測定參照GB/ T6438-2007。牛奶中干物質(zhì)、粗蛋白和鈣含量，參見飼料分析文獻方法。

1.3.2 奶牛精料和牛奶中外源基因檢測 奶牛精料DNA提取方法：采用GenoDNA Plant mini Kit-Genomic DNA Isolation kit試劑盒(Ambiogen安比奧生物科技有限公司，中國)提取精料DNA，采取熒光定量PCR法檢測牛奶和牛精料中外源基因。核酸質(zhì)量檢測：分別取40μl DNA溶解液，用TE緩沖液稀釋25倍后，用紫外分光光度計測其在A260，A280nm波長處的光吸收值。精料DNA和牛奶DNA純度以O(shè)D260/280表示，A260/A280值分別為1.92和1.80，均大于1.70(比值在1.7～2.0之間較好)，符合PCR檢測要求。外源基因檢測：采用實時熒光PCR儀檢測提取核酸的外源基因。反應(yīng)條件：在96孔 PCR反應(yīng)板的反應(yīng)孔中，依次加入2.5ul 10×PCR緩沖液，2.0ul 4×dNTP (2.5 mmol/L)，0.5ul 20pmol/ul引物F，0.5ul 20pmol/ul引物R，0.2ul TaqDNA聚合酶(5U/ul)，2.0ul mgCl2(25mmol/ L)，0.5～2.0ul(10～50ng)DNA模板，0.5ul 20pmol/ul探針，加入去離子水使反應(yīng)體積達到25ul。PCR反應(yīng)的設(shè)置為95℃，10min；95℃，5s；60℃，60s進行45個循環(huán)。

2 結(jié)果及分析

2.1 奶牛精料中營養(yǎng)成分含量

7個牛場奶牛精料的常規(guī)營養(yǎng)成分含量見表1。

表1 奶牛精料的常規(guī)營養(yǎng)成分含量 (%)

由表1可知，各奶牛場精料的營養(yǎng)成分含量有不同程度差異，粗蛋白質(zhì)、粗纖維含量各場差異不顯著(P>0.05)；水分含量范圍為7.37%～10.21%、粗灰分含量在7.28%～9.15%范圍內(nèi)、鈣含量在7.28%～9.15%范圍內(nèi)、總磷含量在0.41%～ 0.73%范圍內(nèi)，上述指標(biāo)不同牛場間差異達顯著水平(P<0.05)。

2.2 牛奶營養(yǎng)成分含量測定

7個牛場牛奶營養(yǎng)成分含量見圖1。7個牛場牛奶中營養(yǎng)成分含量差異不顯著(P>0.05)。

圖1 7個牛場牛奶營養(yǎng)成分含量

2.3 牛精料和牛奶外源基因檢測結(jié)果

牛精料和牛奶中外源基因檢測結(jié)果顯示，1、2、3、7號牛場精料中含轉(zhuǎn)基因豆粕GTS40-3-2和2704品系外源基因，4、5、6號含轉(zhuǎn)基因豆粕GTS40-3-2品系外源基因。牛奶中均未檢測到相應(yīng)外源基因。

3 討論

馬永喜等研究表明，肉雞飼喂轉(zhuǎn)基因豆粕日糧，其胸肌和腿肌中檢測不到豆粕外源基因。王長康等報道，飼喂轉(zhuǎn)基因豆粕日糧的蛋雞和番鴨的血液、肌肉和內(nèi)臟器官、蛋、糞便中沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因成分。朱元招等研究表明，生長豬飼喂轉(zhuǎn)基因豆粕日糧，其肌肉、肝臟、脾臟和胸腺中未發(fā)現(xiàn)外源基因。趙志輝 等用轉(zhuǎn)基因水稻飼喂大鼠也得出了類似結(jié)論。Phipps等對飼喂青貯Bt玉米的牛奶進行了檢測，所檢測奶樣中不存在轉(zhuǎn)基因DNA片段。Jennings等研究表明，飼喂轉(zhuǎn)基因豆粕豬肌肉中未發(fā)現(xiàn)外源基因存在。一般情況下從食糜中釋放出的裸露DNA在消化道內(nèi)能夠迅速降解，但有報道認(rèn)為動物飼料中的某些DNA可以逃逸動物體內(nèi)核酸酶的作用而發(fā)生轉(zhuǎn)移，懷孕母鼠可把外源DNA通過胎盤轉(zhuǎn)移到胎兒的體細胞中并可整合到染色體組內(nèi)。本試驗結(jié)果表明，所調(diào)查7個牛場精料中均含有轉(zhuǎn)基因豆粕外源基因，牛奶中均未檢測到相應(yīng)外源基因，且牛奶主要營養(yǎng)成分沒有顯著差異。

4 小結(jié)

本試驗研究表明，7個牛場精料常規(guī)營養(yǎng)成分有不同程度差異，粗蛋白質(zhì)、粗纖維含量各場差異不顯著(P> 0.05)；水分、粗灰分、鈣、總磷含量不同牛場間差異顯著(P<0.05)。牛奶中的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和鈣含量7個牛場之間差異不顯著(P>0.05)。4個牛場精料中含轉(zhuǎn)基因豆粕GTS40-3-2和2704品系外源基因，3個牛場精料中含轉(zhuǎn)基因豆粕GTS40-3-2品系外源基因。牛奶中均未檢測到相應(yīng)外源基因。

[1]杜紅方.基因水稻作為肉仔雞日糧原料的安全性評價[D].北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院.2006.

[2]蔣亦武, 黃明, 王保戰(zhàn)等.轉(zhuǎn)基因大豆及制品中轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)研究進展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 1: 345-348.

[3]馬永喜, 朱元招, 臧建軍等.抗草甘膦大豆粕外源DNA在肉雞體內(nèi)代謝研究[J].飼料研究, 2010, 4: 7-8.

[4]王長康, 陳文炳, 邵碧英等.飼料中的轉(zhuǎn)基因成分在家禽體內(nèi)代謝殘留的研究[J].食品科學(xué), 2007, 28(8): 428-432.

[5]張麗英.飼料分析與飼料質(zhì)量檢測技術(shù)(3版) [m].北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2003: 48-150.

[6]趙志輝, 楊立桃, 艾曉杰等.轉(zhuǎn)codA基因的耐鹽堿水稻對大鼠生理代謝的影響及外源基因的水平轉(zhuǎn)移[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2005, 13(3): 341-346.

[7]朱元招, 尹靖東, 李德發(fā)等.生長豬對轉(zhuǎn)基因豆粕外源DNA的代謝研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2005, 36(10): 1083-1086.

[8]Jennings J.C., D.C.Kolwyck,S.B.Kays, et al.Determining whether transgenic and endogenous plant DNA and transgenic protein are detectable in muscle from swine fed Roundup Ready soybean meal[J].Journal of Animal Science,2003,81:1447-1455.

[9]PhiPPs R.H.，D.E.Beever，A.p.Tingey.Detection of transgenic DNA in bovine milk: results for cows receiving a TmR containing maize grain modified for insect protection (mON810)[J].Journal of Animal Science, 2001,79(supplement 1): Abstracts No.476.