牛病毒性腹瀉病毒抗原抗體檢測方法研究進展

趙 霞，岳海寧，馬占绔，李福虹

(1.青海省西寧市大通縣朔北獸醫站，青海西寧 810100;2.甘肅農業大學，甘肅蘭州 730070)

牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的以牛發熱、粘膜糜爛潰瘍、腹瀉、咳嗽、母牛流產、繁殖障礙為主要特征的持續性感染病，是導致牛生產性能下降的主要疫病之一，呈世界性分布，給全球養牛業帶來巨大的經濟損失，我國養牛比較發達地區幾乎都存在該病的感染［1－4］。BVDV為黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的代表種，根據其5’端非翻譯區核酸序列分為基因I型和II型［5］。BVDV-I和BVDV-II所引起的臨床癥狀、發病特點及致病性明顯不同，BVDV-I常引起過性發熱、下痢和急慢性粘膜病［6］;BVDV-II在臨床上常表現為發燒、腹瀉、出血、呼吸失調、可引起懷孕母牛流產、死胎和新生小牛的先天畸形，對牛的致死率較高，危害性更為嚴重［7］。我國BVDV的主要流行毒株為BVDV-I型，但近年來分離與鑒定到BVDV-II型的報道逐漸增多［8－9］。只有研制快速、準確、靈敏和特異的 BVDV檢測方法并將其推廣應用，才能更好地診斷和控制該病。BVDV的常用診斷方法有病毒分離、電鏡檢查、中和試驗、瓊脂擴散試驗和免疫熒光等，這些方法不僅操作繁瑣、復雜耗時、難以實現快速診斷，而且敏感性均較低，對處于免疫耐受和持續性感染牛容易出現漏檢。隨著現代分子生物學與免疫學技術的快速發展與應用，BVDV新型抗原抗體檢測方法不斷發展和完善。筆者就近年來針對BVDV的RT-PCR、熒光定量RT-PCR、RT-LAMP、ELISA和膠體金技術等抗原抗體新型檢測方法進行了綜述，以期為不同實驗室尋找適合的診斷方法以及發展新型診斷方法提供參考，為我國牛病毒性腹瀉病的綜合防控提供合理的科學依據。

1 牛病毒性腹瀉病毒的抗原檢測方法

1.1 RT-PCR

1.1.1 通用性RT-PCR及套式RT-PCR。王偉利等根據BVDV 5’端非編碼區(5’-UTR)設計合成l對特異性引物，建立檢測BVDV的RT-PCR方法，該方法對3株BVDV毒株的檢測均為陽性，對牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、豬瘟病毒(CSFV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛冠狀病毒(BCV)的檢測結果均呈陰性，與病毒分離試驗的符合率達100%［10］。該方法特異性強，敏感性高，可以用于臨床BVDV的檢測及流行病學調查。郭春娟等建立了檢測BVDV I型和Ⅱ型抗原的通用RT-PCR方法，該方法檢測BVDV I型和II型標準毒株均呈陽性，檢測 IBRV、CSFV、藍舌病病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、MDBK細胞均呈陰性，檢測的靈敏度為 10－1TCID50/ml，檢測 400 份臨床樣品，陽性檢出率為 10.75%［11］，明顯高于ELISA檢測結果。該方法具有特異、靈敏、高效、快速、重復性好等特點，為BVDV的檢疫、診斷及流行病學調查提供了一種有效的技術手段。Bachofen C等根據BVDV 5’-UTR設計引物，建立了從牛的血清中進行BVDV檢測一步RT-PCR方法［12］，該方法放在1個96孔進行PCR擴增，提高了檢測速度，降低成本、操作時間和潛在的污染，具有高通量、低成本等優點，值得推廣應用。

祖立闖等根據BVDV 5＇非編碼區，設計2對特異性引物，建立了檢測BVDV的套式RT-PCR方法，檢測CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、MDBK細胞、IBRV、豬偽狂犬病毒(PRV)均呈陰性，第1輪RT-PCR檢測靈敏度為1 pg，而套式RT-PCR檢測靈敏度達到0.1 pg。在臨床51份樣品的檢測中，第1輪RT-PCR檢測出陽性樣品11份，而套式RT-PCR檢測出陽性樣品22份［13］。套式RT-PCR極大地提高了常規RT-PCR檢測方法的特異性和敏感性，可以準確快速檢測出極低含量的BVDV，為BVDV的早期感染和持續感染提供了簡單、實用的有效診斷方法。

1.1.2 基因分型RT-PCR。熊浩等比較并分析了BVDV I型和II型5’-UTR，分別設計合成2對針對基因I型和II型的特異性檢測引物，通過對RT-PCR反應條件的優化建立了在同一反應體系中同時檢測BVDV基因I型和Ⅱ型的雙重RTPCR方法，該方法對2個基因型的病毒檢測靈敏度均為2 TCID50，只比單重PCR的靈敏度降低了10倍，但具有較好的特異性和可重復性，對新疆5個不同牛場的175份流產牛全血和組織樣品進行檢測，共6份BVDV-I型陽性，沒有檢測到BVDV-II型［14］。王克棟等根據BVDV I型和II型5’-UTR 分別設計合成2對引物，根據牛3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因設計合成1對引物，以牛GAPDH基因為內標建立了牛病毒性腹瀉病毒分型與內標三重RT-PCR檢測方法，該方法的靈敏度為100 TCID50，與不加內標檢測靈敏度相當［15］，經臨床樣品檢測驗證具有較好的特異性和重復性，可用來對牛病毒性腹瀉病毒分型進行快速準確檢測。多重PCR方法可在同一個體系中同時對BVDV I型和II型基因進行擴增，實現了對2個基因型的BVDV進行同步分型檢測，大大節省了檢測時間和檢測成本，為臨床中BVDV-I和BVDV-II的鑒別診斷和流行病學調查等研究提供了有效技術支持。

1.2 熒光定量RT-PCR 任艷等以BVDV 5’-UTR為參考，設計并優化1對特異的熒光定量PCR引物，建立一種快速、定量檢測BVDV的熒光定量RT-PCR方法，該方法的靈敏性比常規PCR高10倍，檢測變異系數低于1%，檢測25份不同地區采集的臨床癥狀疑似BVDV感染的牛糞樣品，陽性檢出率為72%［16］。與病毒分離培養和電檢觀察相比，該方法具有快速、靈敏、特異、重復性好和能定量檢測等優點，為實驗室快速、準確檢測BVDV奠定了基礎。陳其兵等根據BVDV 5’UTR設計合成了1對特異性引物和1條TaqMan熒光探針，通過對反應條件和反應體系的優化建立了一種能快速定量檢測BVDV的熒光定量RT-PCR方法，該方法檢測CSFV、PRRSV、MDBK細胞均呈陰性，病毒含量的最低檢測限為103～104拷貝/ml，具有快速、特異、靈敏、重復性好等特點，可用于臨床及科研中對BVDV的快速定量檢測和肉類食品進出口檢疫［17］。熒光定量RT-PCR方法表現出更高的敏感性。熒光定量PCR檢測方法與RT-PCR檢測方法相比其敏感性與特異性更高，可以對BVDV進行早期診斷，及時發現病源，且可以實現定量檢測，具有廣闊的開發應用前景。

1.3 RT-LAMP方法 環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)檢測技術是在PCR方法上發展起來的新興核酸檢測技術，可在恒溫條件下方便、快速、靈敏、特異的檢測核酸，具有較高的臨床實用性。范晴等根據BVDV5’-UTR，在保守區的8個位點設計LAMP特異性引物，對反應條件和試劑濃度進行優化，建立BVDV的RT-LAMP快速檢測方法，該方法在63.5℃的恒溫條件下65 min內即可完成檢測，可通過觀察渾濁度或加入染料后直接判定擴增結果。經檢測發現牛結核桿菌、BRV、CSFV、IBRV均為陰性，靈敏度可以達到 1 拷貝/μl，是常規 RT-PCR 的 105倍［18］。Fan Q等建立了BVDV RT-LAMP快速檢測方法，該檢測與其他牛病毒沒有交叉反應，與熒光定量RT-PCR方法同時檢測88份臨床樣品，RT-LAMP方法檢測出陽性38份，熒光定量RT-PCR方法檢測出陽性39份，RT-LAMP方法的靈敏度與熒光定量RT-PCR方法相當，可用于基層BVDV臨床病料的現場檢測和快速診斷［19］。RT-LAMP檢測方法快速、成本低、特異性好、靈敏度高、尤其適用于基層和現場檢測，為BVDV的檢測提供了新的技術方法，對BVDV的有效防制具有重要意義。

1.4 夾心ELISA方法 蔣穎等將BVDV 890株(BVDV-II型)病毒液濃縮并純化后免疫BALB/c小鼠制備的單克隆抗體3D8為捕獲抗體，單克隆抗體3F9經生物素標記后為檢測抗體，建立檢測BVDV的雙抗體夾心ELISA方法，該方法檢測BVDV 890株(BVDV-II)、NADL株(BVDV-I))、XJ-04株(BVDV-II)均呈陽性，檢測CSFV、I型牛皰疹病毒(BHV-1)、BRV均呈陰性，對BVDV抗原的最低檢出量為84 ng/ml，檢測35份臨床病牛血清樣品，檢出陽性血清13份，與RT-PCR的符合率達到94.29%［20］。該方法具有特異、靈敏、可靠、方便、快捷等特點，可廣泛推廣應用，為我國BVDV的監測提供了行之有效的技術手段。楊俊興用純化的BVDV作為抗原，經動物免疫、細胞融合、間接ELISA篩選和亞克隆，得到3株抗BVDV的單克隆抗體(2A6、2F4和5C9)，選用2A6和5C9作為包被抗體，用辣根過氧化物酶(HRP)標記的單克隆抗體2F4作為夾心抗體，建立了檢測發現BVDV的雙單克隆抗體夾心ELISA方法，檢測發現BVDV(I型和II型)呈陽性，檢測CSFV、赤羽病病毒(AKV)、BRV、FMDV均呈陰性，該方法與RT-PCR和商品化ELISA試劑盒的符合率分別為98.8%和99.0%［21］。該ELISA方法具有良好的特異性和敏感性，可以代替商品化ELISA試劑盒，可用于BVDV抗原快速檢測和對大量樣本的篩選。夾心ELISA檢測方法將單克隆抗體的特異性和酶標記技術的敏感性有機地結合起來，能夠在短時間內準確、快速、直接檢測大批量樣品中的BVDV抗原，明顯優于病毒分離和免疫熒光等方法，而且具有半自動化的特點，更適合于各級獸醫研究機構在大面積普查和流行病學調查中應用。

2 牛病毒性腹瀉病毒的抗體檢測方法

2.1 間接ELISA方法 柴順秀等用BVDV重組E2蛋白作為包被抗原，HRP標記葡萄球菌A蛋白(SPA)作為二抗，建立了檢測BVDV血清抗體的E2-PPA-ELISA方法，該方法檢測CSFV、BCV、BRV陽性血清均呈陰性，靈敏度達1∶320，285份血清樣本的陽性檢出率為33.4%，與IDEXX ELISA試劑盒的檢出率無明顯差異［22］。該方法具有良好的重復性、敏感性和特異性，為BVDV的快速診斷和流行病學調查提供一種快速、簡便的血清學診斷方法，適合規模化養牛場BVDV的抗體監測以及流行病學調查。Mayers J等建立了一種間接復合ELISA，可以同時檢測BVDV、BHV-1、牛副流感病毒3(BPV-3)和牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)抗體，減少了檢測試劑的成本，并簡化了試驗操作［23］。Lanyon S R等對BVDV特異性抗體ELISA檢測方法進行了臨床應用和效果評價，采用ELISA和病毒中和試驗同時檢測125份牛血清樣品，采用ELISA和AGP同時檢測1 182份未免疫牛血清血清樣品，ELISA方法與病毒中和試驗的敏感性和特異性分別為96.7% 和97.1%，ELISA方法與瓊擴試驗相比，敏感性更高［24］。Gonda M G等利用BVDV ELISA抗體檢測方法對BVDV疫苗免疫后的血清抗體效價進行了檢測，結果表明ELISA方法可以用于BVDV-I型和II型中和抗體的效價檢測，評價疫苗免疫效果［25］。間接ELISA方法高通量、檢測快速、操作簡單，是目前常用的免疫學抗體診斷技術，可廣泛用于BVDV的抗體檢測和流行病學調查。

2.2 膠體金方法 張寧等利用BVDV標準毒株作為免疫原免疫健康家兔，制備抗BVDV高免血清，采用辛酸－硫酸胺法提純免疫球蛋白IgG，同時采用鞣酸－檸檬酸三鈉混合還原法制備5 nm膠體金顆粒。在電磁攪拌下，利用膠體金顆粒標記兔抗BVDV IgG制備金標抗體，采用雙抗體夾心法建立了檢測BVDV的斑點免疫金銀染色方法(Dot-ELISA)，該方法檢測CSFV、BRV、MDBK細胞、健康牛血樣均為陰性，抗原最低檢出量為0.335 μg/ml，該方法和AGP方法同時檢測78份河北省不同地區采集腹瀉奶牛血樣品，Dot-IGSS和AGP的陽性檢出率分別為 58.97%和 34.62%［26］，Dot-IGSS 方法的陽性檢出率明顯高于AGP方法。膠體金標記技術具有快速、方便、簡單、不需要昂貴儀器和專業人員、肉眼判讀、試驗結果易保存等優點，特別適合于基層獸醫部門和養殖場推廣應用，具有廣闊的發展和推廣應用前景，具有高度敏感性，非常適用于臨床診斷和檢疫。

3 小結

牛病毒性腹瀉是危害我國養牛業健康發展的主要疫病之一，加強其診斷技術研究與監測工作對BVDV綜合防控措施的制定具有重要意義。對BVDV的檢測要力爭做到快速、敏感、準確，這對于感染動物的隔離與治療以及對未感染動物快速采取預防措施都十分重要。目前，BVDV敏感、快速、特異的檢測技術主要有針對病毒DNA的抗原檢測技術和針對病毒產生抗體的抗體檢測技術，抗體檢測可以了解BVDV感染與發生進程，但動物在BVDV感染一定時間后才會產生抗體，因此抗體檢測存在一定的滯后性和局限性。分子生物學等抗原檢測方法可以敏感、特異地檢測出病毒核酸，其中熒光定量RT-PCR方法較RT-PCR方法更加敏感，但該方法對試驗試劑與機器要求較高，難以在普通實驗室普及應用。RT-LAMP方法操作簡單、不需要特殊儀器設備，肉眼判讀、特別適合于基層實驗室應用。ELISA檢測方法檢測快速、高通量，適合用于大批量樣品檢測和大面積流行病學調查。總而言之，BVDV的各種抗原抗體檢測方法均有優缺點，可根據檢測實際選擇2種或2種以上方法進行使用，相信隨著分子生物學與免疫學技術的進一步發展與應用，牛病毒性腹瀉病毒新型抗原抗體檢測方法還會不斷完善，從而為我國牛病毒性腹瀉病的綜合防控提供更加合理依據。

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