熒光光譜法研究左氧氟沙星、拉米夫定同時(shí)與牛血清白蛋白的相互作用

胡 威，付彩霞，黃玉玲

（濱州醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，山東煙臺(tái)264000）

左氧氟沙星（LVFX），具有廣譜抗菌作用，毒性小，療效高，是目前臨床上廣泛應(yīng)用的新一代喹諾酮類藥物，通過抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ活性，阻止細(xì)菌DNA的合成和復(fù)制。拉米夫定（LMVD），是新一代核苷類抗病毒藥，強(qiáng)烈抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)磷酸化后與脫氧胞嘧啶核苷（dCTP）競爭，摻入合成的DNA鏈中，使病毒不能繼續(xù)延伸而終止復(fù)制［1－2］。

作者在此采用熒光光譜法研究左氧氟沙星和拉米夫定同時(shí)與牛血清白蛋白的相互作用，擬為臨床合理用藥提供指導(dǎo)［3－4］。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試藥與儀器

牛血清白蛋白第五組分，上海生物工程有限公司；拉米夫定，杭州創(chuàng)世紀(jì)醫(yī)藥科技有限公司；左氧氟沙星，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠；三羥甲基氨基甲烷（Tris），北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；0.1mol ·L－1NaCl水溶液，煙臺(tái)中環(huán)化學(xué)試劑有限公司。

KQ－600TDE型超聲波清洗儀，昆山舒美超聲儀器有限公司；AR1140型電子分析天平，ohaus，corp.pineBrook Nj USA；LS55型熒光／磷光／發(fā)光分光光度計(jì)，美國Perkin－Elmer公司；比色管（10mL）。

1.2 方法

1.2.1 2種藥物分別對BSA的相互作用

準(zhǔn)確配制濃度為1.0×10－6mol·L－1的BSA的Tris－HCl溶液25mL，靜置，取3mL轉(zhuǎn)移至石英比色皿中，以微量注射器加入10μL的拉米夫定或左氧氟沙星，旋渦混勻。設(shè)定熒光激發(fā)波長為280nm，在300～550nm范圍內(nèi)掃描熒光光譜，分別討論2種藥物對BSA的熒光猝滅作用（以空白的BSA溶液熒光強(qiáng)度為F0）。

1.2.2 2種藥物共同對BSA的相互作用

準(zhǔn)確量取7.5mL 1.0×10－6mol·L－1的BSA的Tris－HCl溶液和10μL 1.0×10－4mol·L－1的LVFX溶液于25mL容量瓶中，定容后靜置。取3mL轉(zhuǎn)移至石英比色皿中，用微量注射器加入一定量的LMVD（加入后混合均勻并靜置30min），使其濃度（×10－6mol·L－1）為0、1、2、3、4、5、6。討論LVFX存在時(shí)，LMVD對BSA的熒光猝滅作用（以未加LMVD的BSA－LVFX溶液的熒光強(qiáng)度為F0）。

同理，討論LMVD存在時(shí)，LVFX對BSA的熒光猝滅作用。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅光譜

BSA－LVFX、BSA－LMVD、BSA－LVFX－LMVD、BSA－LMVD－LVFX 4種體系的熒光猝滅光譜如圖1所示。

圖1 BSA－LVFX（a），BSA－LMVD（b）、BSA－LVFX－LMVD（c）、BSA－LMVD－LVFX（d）4種體系的熒光猝滅光譜Fig.1 Quenching fluorescence spectra of four kinds of systems BSA－LVFX（a），BSA－LMVD（b），BSA－LVFX－LMVD（c），BSA－LMVD－LVFX（d）

由圖1可看出，左氧氟沙星／拉米夫定的加入使BSA的熒光光譜發(fā)生了劇烈的猝滅作用，這種作用在左氧氟沙星／拉米夫定溶液一開始加入時(shí)就可以觀察到，表明BSA的1個(gè)高親和結(jié)合位點(diǎn)位于色氨酸殘基的附近。當(dāng)以280nm波長進(jìn)行激發(fā)時(shí)，BSA在350 nm附近有最大發(fā)射峰，隨著左氧氟沙星／拉米夫定的加入可以觀察到典型的熒光猝滅行為。在混合體系中同樣可以觀察到強(qiáng)烈的熒光猝滅行為。

2.2 熒光猝滅機(jī)制

熒光猝滅可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是激發(fā)態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子之間的相互碰撞而導(dǎo)致的熒光猝滅。靜態(tài)猝滅是基態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子通過弱的結(jié)合形成復(fù)合物，并吸收熒光分子發(fā)出的熒光，形成的復(fù)合物隨著體系溫度的升高會(huì)逐漸分解，靜態(tài)猝滅效應(yīng)逐漸降低。靜態(tài)猝滅可用下式描述：

式中：F0、F分別為無、有猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度；Ks為靜態(tài)猝滅常數(shù)；c為小分子猝滅劑的游離濃度。

假設(shè)左氧氟沙星、拉米夫定對BSA熒光的猝滅是動(dòng)態(tài)猝滅，則應(yīng)滿足Stern－Volmer猝滅方程［5］：

式中：Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)；τo為生物大分子的平均熒光壽命，10－8s；KSV為Stern－Volmer動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)。

根據(jù)式（2），對4種體系進(jìn)行線性擬合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種體系中藥物與BSA相互作用的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.9993、0.9993、0.9917、0.9995，線性關(guān)系較好。

根據(jù)擬合結(jié)果，繪制BSA－LVFX、BSA－LMVD、BSA－LVFX－LMVD、BSA－LMVD－LVFX 4種體系的Stern－Volmer曲線，如圖2所示。

圖2 BSA－LVFX（a）、BSA－LMVD（b）、BSA－LVFX－LMVD（c）、BSA－LMVD－LVFX（d）4種體系熒光猝滅的Stern－Volmer曲線Fig.2 Stern－Volmer Curves for fluorescence quenching of four kinds of systems BSA－LVFX（a），BSA－LMVD（b），BSA－LVFX－LMVD（c），BSA－LMVD－LVFX（d）

計(jì)算表明，左氧氟沙星、拉米夫定對BSA的熒光猝滅速率常數(shù)Kq值（表1）遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對生物大分子的最大動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)2.0×1010L ·mol－1·s－1，證實(shí)了原假設(shè)不成立，猝滅過程應(yīng)為形成復(fù)合物引起的靜態(tài)猝滅。

2.3 結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

馮喜增等［6］推導(dǎo)出靜態(tài)猝滅中熒光強(qiáng)度與猝滅劑的關(guān)系：

lg［（F0－F）／F］和lgc成正比關(guān)系，根據(jù)式（3）求出左氧氟沙星、拉米夫定與BSA的結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，如表1所示。

表1 左氧氟沙星、拉米夫定與BSA的猝滅反應(yīng)參數(shù)Tab.1 Quenching parameters of BSA reaction with LVFX，LMVD

由表1可知：（1）結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均約為1；（2）左氧氟沙星KA是拉米夫定KA的3.5倍，說明左氧氟沙星與BSA結(jié)合能力大于拉米夫定與BSA的結(jié)合能力；（3）藥物混合體系中，拉米夫定存在時(shí)左氧氟沙星與BSA結(jié)合常數(shù)KA是藥物單體左氧氟沙星的KA的8.3倍，表明拉米夫定使左氧氟沙星與BSA的結(jié)合穩(wěn)定性增強(qiáng)，游離的左氧氟沙星減少；同理，左氧氟沙星存在時(shí)拉米夫定與BSA的結(jié)合常數(shù)KA是藥物單體拉米夫定的KA的13.57倍，表明左氧氟沙星的存在也使拉米夫定與BSA的結(jié)合穩(wěn)定性增強(qiáng)，游離的拉米夫定減少。

3 結(jié)論

應(yīng)用熒光光譜法研究了左氧氟沙星和拉米夫定同時(shí)與BSA的相互作用。結(jié)果表明，2種藥物對BSA的熒光都存在靜態(tài)猝滅作用；當(dāng)2種藥物共存時(shí)，一種藥物會(huì)使另一種藥物與BSA的結(jié)合穩(wěn)定性提高，游離藥物含量減少，藥效降低。

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