鹽酸小檗堿對小鼠脾細胞的DNA損傷和氧化性損傷

王 璐，惠秀娟，李雙雙，徐成斌，陳忠林，何 蕾

遼寧大學環境學院，沈陽 110036

黃連素(berberine)又名小檗堿，是存在于小檗科、罌栗科、毛莨科、蕓香科和防己科等植物中的一種黃色的異喹啉類生物堿[1-3]，具有廣泛的生物學作用。小檗堿因所含取代基的不同常表現為鹽酸小檗堿與硫酸小檗堿兩種形式，我們臨床中常使用的清熱解毒和抗菌類治療藥物其主要成分多為鹽酸小檗堿。國內外對于鹽酸小檗堿藥用價值的研究已證實，鹽酸小檗堿具有抗腫瘤、降血糖、抗心律失常、免疫調節等多種藥理活性[4-5]。同時作為廣譜抗生素的一種，它能抑制多種革蘭氏陰性菌G-、革蘭氏陽性菌G+以及真菌的生長繁殖[6]。

但是研究發現，鹽酸小檗堿也表現出一定的毒副作用。由于鹽酸小檗堿快速的殺菌、消炎作用[7-8]，鹽酸小檗堿作為抗菌性藥物，被大劑量的添加在飼料中，以促進牛、豬等抗病而快速生長；調查結果顯示全球每年生產的抗菌類藥物(鹽酸小檗堿、土霉素、水楊酸等)中，約有60%被用來作為生長劑及治療藥物飼喂動物。此類藥物進入生物體后，并不能完全被吸收，其中80%以上以原藥形式排出體外，有些抗菌性藥物在生物體內經生物轉化，生成毒性更大的代謝物隨糞便和尿液排出體外。這些抗菌藥及其代謝物隨雨水地表徑流污染地表水，或通過滲濾作用污染地下水。盡管濃度很低，但由于其在養殖業和畜牧業中被長期、大量、頻繁的施用，因此，對整個生態系統和人體健康構成極大的潛在威脅。在排放入環境水體的合成鹽酸小檗堿的沖洗廢水中，調查結果顯示鹽酸小檗堿的濃度高達1 000 mg·L-1左右。

鹽酸小檗堿也能呈濃度依賴性地誘導原代培養的大鼠大腦皮質和小腦顆粒神經元壞死[9]。在一定濃度范圍內，鹽酸小檗堿會對小鼠脾細胞的增殖具有抑制作用[10]。脾是血液循環中重要的濾過器，它能清除血液中的異物、病菌以及衰老死亡的細胞，同時也是人和動物的重要外周免疫器官，在機體內發揮免疫作用。藥理以及毒理等多種實驗中，都把脾作為靶器官進行研究。因而，為了深入研究鹽酸小檗堿對小鼠脾細胞的損傷作用以及其潛在的環境影響，本研究從細胞及分子水平上，以小鼠脾細胞為實驗對象，通過彗星實驗及抗氧化酶實驗研究鹽酸小檗堿對小鼠脾細胞的DNA損傷和氧化性損傷，為進一步研究鹽酸小檗堿的遺傳毒性、毒性機理以及具體氧化性應激反應等提供科學依據。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 主要實驗試劑

鹽酸小檗堿為分析純(國藥集團化學試劑沈陽有限公司)；溴化乙錠(EB)，正常熔點瓊脂糖(NMA)、低熔點瓊脂糖(LMA)，二甲亞砜(DMSO)，過氧化氫(H2O2)，硫代巴比妥酸等(美國Sigma 公司)。

1.2 動物分組及處理

實驗選擇ICR雄性小鼠(沈陽醫學院實驗動物中心)，體重25～30 g 左右，常規喂養兩周后選取健康的小鼠進行實驗。按SAS隨機分組程序將小鼠隨機分為7組，即對照組和7.5、15、30、60 和120 mg·kg-1鹽酸小檗堿劑量組。采用灌胃方式染毒，末次染毒6 h 后處死小鼠。按文獻方法[11]進行取材、處理。

1.3 指標測定方法

1.3.1 彗星實驗

參照Singn等人的彗星實驗方法[12]，并適當加以改動[13-14]。熒光顯微鏡下用515～560 nm的激發光觀察，每張玻片用圖像采集系統在×200下隨機采集50個彗星圖像，用CASP(Comet Assay Software Project)圖像分析軟件測定尾部DNA含量、尾長和尾矩。

1.3.2 生化測定

參照楊曉霞等人的實驗方法。SOD 活性采用氮藍四唑法測定；POD采用愈創木酚法測定；CAT 活性采用羥胺氧化法測定；MDA使用硫代巴比妥酸比色法測定[15-18]。SOD、POD和CAT比活用每mg蛋白酶活單位(U)表示，MDA結果以單位質量蛋白質中能與TBA反應的物質(TBARS)的納摩爾數(nmol·g-1)表示。

1.4 數據處理

實驗數據使用Excel 2010軟件進行整理，采用SPSS 19.0軟件進行方差分析和顯著性檢驗，并進行Tukey多重比較檢驗。實驗結果以Mean±SD表示。

2 結果(Results)

2.1 體外彗星實驗結果

鹽酸小檗堿對小鼠脾細胞的體外彗星實驗結果如表1。從表1可見，體外給予10 mg·L-1鹽酸小檗堿后，小鼠脾細胞尾部DNA含量、尾長和尾矩即明顯增加(p<0.01)。表明鹽酸小檗堿造成了小鼠脾細胞DNA損傷。且隨鹽酸小檗堿濃度的增高，呈明顯的劑量-效應關系。

2.2 體內彗星實驗

鹽酸小檗堿對小鼠脾細胞的體內彗星實驗結果如表2。從表中可見，5個劑量組與陰性對照組相比，尾部DNA含量、尾長及尾矩均呈現增加趨勢，當濃度增加至30 mg·kg-1后，差異有統計學意義(p<0.01)。說明一定劑量的鹽酸小檗堿對小鼠脾細胞DNA有損傷作用。隨著鹽酸小檗堿濃度的升高，小鼠脾細胞尾部DNA含量、尾長、尾矩都呈現增加趨勢, 且與濃度呈劑量-效應關系。使用臺盼蘭進行細胞存活率測定時，實驗前細胞存活率均在95%以上，染毒后的細胞存活率也在90%以上，說明DNA損傷為受試物作用所致，而非細胞毒性。

2.3 鹽酸小檗堿對小鼠組織內SOD、CAT、POD活力以及MDA含量的影響

不同劑量鹽酸小檗堿對小鼠脾細胞SOD、CAT、POD活性以及MDA濃度的影響如圖1-4。數據表明，高劑量的鹽酸小檗堿能夠抑制抗氧化酶的活性。隨著鹽酸小檗堿濃度的升高，SOD與CAT活性逐漸降低，與對照組相比差異顯著(p<0.05)。POD活性在7.5 mg·kg-1時，活性被激活，活性增加極顯著(p<0.01)。MDA含量隨鹽酸小檗堿濃度的增加呈上升趨勢，且與濃度呈劑量-效應關系。

表1 鹽酸小檗堿體外彗星實驗結果(x±s)Table 1 The results of comet assay(x±s)

注：與陰性對照組相比，ap<0.05，bp<0.01。

Note：Significant differences from the control are indicated asap<0.05,bp<0.01.

表2 鹽酸小檗堿體內彗星實驗結果(x±s)Table 2 The results of comet assay(x±s)

注：與陰性對照組相比，ap<0.05，bp<0.01。

Note：Significant differences from the control are indicated asap<0.05,bp<0.01.

圖1 不同劑量下染毒后小鼠細胞SOD變化情況Fig. 1 The change of SOD activity after exposure to different concentrations of berberine

圖2 不同劑量下染毒后小鼠細胞POD變化情況Fig. 2 The change of POD activity after exposure to different concentrations of berberine

圖3 不同劑量下染毒后小鼠細胞CAT變化情況Fig. 3 The change of CAT activity after exposure to different concentrations of berberine

圖4 不同劑量下染毒后小鼠細胞MDA變化情況Fig. 4 The change of MDA activity after exposure to different concentrations of berberine

3 討論(Discussion)

實驗結果表明，一定劑量的鹽酸小檗堿對小鼠脾細胞有明顯的DNA損傷與氧化性損傷作用。彗星實驗中，隨著鹽酸小檗堿濃度的增加，小鼠脾細胞DNA單鏈斷裂增多，電泳后，隨電子遷移的距離也明顯增大。脾細胞受損度增高，尾部DNA含量，尾長、尾矩均增加，與陰性對照組相比，差異有統計學意義(p<0.01)。可得出在一定劑量范圍內鹽酸小檗堿能夠引起小鼠脾細胞的DNA損傷，對小鼠具有一定的遺傳毒性。但其造成損傷的機理還有待于進一步研究。

且小鼠脾細胞中MDA含量明顯上升，SOD與CAT 活性逐漸降低，POD活性在7.5 mg·kg-1時上升，而后逐漸下降。30 mg·kg-1后，活性變化與對照組相比，差異顯著(p<0.05)。說明在低劑量時，小鼠脾細胞自身有抵御損傷的作用，能夠有效地清除自由基和活性氧，使細胞免受損傷。但當劑量升高后，機體內產生了大量的自由基在小鼠體內積累，未能被及時清除的自由基降低了抗氧化酶系的活性，同時加重了脂質過氧化反應，使機體內脂質過氧化產物增多，對細胞產生了毒性作用，也進一步說明了鹽酸小檗堿可導致小鼠脾細胞DNA損傷。但對于長期條件下小鼠脾細胞的抗氧化酶系的活性以及MDA含量變化等情況還需要進一步的研究。

綜上所述，彗星實驗、抗氧化酶實驗結果有較好的一致性，能夠有效地證明鹽酸小檗堿對小鼠脾細胞的DNA損傷與氧化性損傷作用。為鹽酸小檗堿進一步遺傳毒性的研究以及后續機理研究提供相關依據。

致謝：感謝遼寧大學環境學院各位老師、同學的幫助和支持。

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