4-硝基酚對大鼠肝臟的毒性及氧化損傷

宋美艷，張永輝，樸元國，李春梅

南京農業大學動物科技學院，南京 210095

環境內分泌干擾物是一類通過干擾生物體內調節發育過程的天然激素的合成、分泌、運輸、結合、反應和代謝等過程，從而對生物體的生殖、神經和免疫系統等的功能產生影響的外源性化學物質。4-硝基酚(4-nitrophenol，PNP)是一種重要的化工原料，廣泛應用于生產殺蟲劑、除草劑、染料、醫藥等行業，常常在生產和使用過程中被釋放到環境中，它們難以降解，在環境中可長期殘留，對土壤、水體和大氣造成嚴重的污染[1-3]，已被美國環境保護局和我國列為“優先控制污染物”之一。最近研究發現柴油車尾氣[4-5]和酸雨[6]中也含有PNP，而且PNP是對硫磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷等有機磷農藥的水解產物[7]。環境中各種來源的PNP嚴重威脅著人類及動物的健康。我們的前期研究發現PNP具有雌激素和抗雄激素樣作用[8]，能夠引起睪丸激素分泌紊亂[9-10]，擾亂雄性大鼠腎上腺皮質類固醇激素的分泌[11]。肝臟是外來化學物質代謝的主要靶器官，PNP在動物體內最終通過葡萄糖醛酸鹽形式或硫酸鹽形式排出[12-13]，其在代謝過程中是否對大鼠肝臟造成影響尚未見報道。

核因子相關因子-2(Nrf2)通路是近年來發現的化學應激的防御性轉導通路，正常情況下，Nrf2和細胞骨架相關蛋白Keap1結合在一起，當機體受到外來化學物質刺激時，兩者分離，Nrf2轉移入核與抗氧化反應元件ARE結合，啟動Nrf2下游靶基因醌氧化還原酶(NQO1)、血紅素加氧酶(HO-1)以及谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)等的表達。我們通過預實驗發現PNP能夠引起大鼠肝臟氧化應激，而Nrf2信號通路是抗氧化應激的主要通路之一，因此本試驗通過對大鼠皮下注射不同劑量的PNP，探討PNP對大鼠肝臟功能及Nrf2信號轉導通路的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料和試劑

1.1.1 主要試劑及儀器

4-硝基酚(4-nitrophenol，PNP，純度99.9%，成都科隆化學品有限公司)，多聚甲醛(上海凌峰化學試劑有限公司)，動物切片石蠟(熔點60～62 ℃，上海國藥集團化學試劑有限公司)，抗氧化和肝功能測試盒(南京建成生物工程研究所)，HE(蘇木精-伊紅)染液(南京建成生物科技有限公司)，反轉錄試劑盒和PCR定量試劑盒(上海皓嘉科技發展有限公司)。

石蠟切片機Leica RM2235和烘片機Leica HI1220(上海徠卡儀器有限公司)，光學顯微鏡Nikon YS100(日本Nikon株式會社)，酶標儀(美國Thermo公司)，5417R型臺式冷凍高速離心機(德國Eppendorf公司)，低溫冷凍離心機J2-MI型(德國Beckman公司)，Real-time PCR儀(美國Bio-rad公司)。

1.1.2 試驗動物和樣品采集

選取20只21日齡SD雄性大鼠(購自南京青龍山實驗動物研究所)，飼養在人工控制的環境中，12 h光照(07:00 至 19:00)和12 h黑暗，溫度(23±2 ℃)，濕度(50%±10%)，自由采食和飲水。隨機分為4組，每組5只，各組間體重無顯著性差異(p>0.05)。溶劑是含0.05% Tween 80的PBS，PNP溶解于溶劑中。預飼一周后，分別皮下注射溶劑1、10和100 mg·kg-1體重的PNP，每天早晨9點注射一次，連續注射28 d。最后一次注射24 h后，大鼠頸動脈采血及采集肝臟樣品。采集的部分肝臟固定于4 %多聚甲醛，用于HE染色；部分樣品用2.5 %戊二醛緩沖液固定，用于透射電鏡觀察；再取一小部分保存于-80 ℃，用于RNA檢測；剩余肝臟保存于-20 ℃，用于生化指標測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 血清肝功能指標檢測

頸動脈采血后，3 500 r·min-1離心15 min，吸取上清液，采用試劑盒測定谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)的活性和總膽紅素(TBIL)的含量。

1.2.2 肝臟組織抗氧化指標檢測

稱取肝臟組織0.1～0.15 g，按重量體積比加入9倍體積的冰冷生理鹽水，用組織勻漿機10 000～15 000 r·min-1充分研磨，然后3 800 r·min-1離心15 min，吸取上清液備用。采用試劑盒測定過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的含量和過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的活性。

1.2.3 肝臟組織結構觀察

對照組和處理組大鼠肝臟組織經4%多聚甲醛固定24 h后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋處理，切片，HE染色，觀察肝臟顯微結構變化。取對照組和100 mg·kg-1PNP組大鼠的部分肝臟，固定于2.5%磷酸戊二醛溶液，環氧樹脂包埋，超薄切片，鋨酸染色，在透射電鏡下觀察肝細胞超微結構的變化并記錄。

1.2.4 肝臟組織總RNA的提取和定量測定

按照Trizol說明書提取肝臟組織的總RNA，提取的RNA保存于-70 ℃超低溫冰箱中，或立即用于反轉錄。反轉錄時，按照Takara Prime Script ? RT reagent Kit反轉錄試劑盒說明書，取上述純化的總RNA 2.0 μg 加入2×RT Buffer 10 μL、20×RT Enzyme Mix 1 μL、Nuclease-free H2O補足至20 μL，置于PCR儀內37 ℃ 15 min，95 ℃反轉錄滅活15 s，反應結束后所得cDNA用于定量PCR。按照Takara SYBR?Premix Ex TaqTM定量試劑盒說明書，依次往定量PCR管加入下列試劑(20 μL體系)：H2O 6.8 μL、引物(10 μmol·L-1各0.4 μL、模板2 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、SYBR Premix Ex Taq 10 μL，混勻離心后在Real-time PCR儀上反應檢測，反應程序如下： 95 ℃變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，重復45個循環；反應結束繪制熔解曲線。利用2-△△Ct法對基因表達進行相對定量，下表為試驗中所用引物序列，見表1。

表1 Real-time PCR所用引物Table 1 Primers for Real-time PCR analyses

1.3 數據統計分析

各組數據均采用平均數±標準誤(Mean ± SEM)表示，數據采用單因素方差分析(ANOVA)，Dunnett 法進行差異性比較，p< 0.05為差異顯著，p< 0.01為差異極顯著，p< 0.001為差異極顯著。以上數據分析均采用GraphPad Prism 5 軟件完成。

2 結果(Results)

2.1 4-硝基酚對大鼠體重和肝臟重量的影響

對照組和PNP處理組大鼠生長正常，體重、肝臟的絕對重量和相對重量均無顯著性差異(p> 0.05)，PNP處理組大鼠的體重與對照組相比，略有下降趨勢，但差異不顯著(p> 0.05)，見表2。

2.2 4-硝基酚對大鼠血清肝功能的影響

與對照組相比，血清中ALT、AST、AKP活性和TBIL含量在100 mg·kg-1組均顯著性升高(p< 0.05)；1 mg·kg-1組AST和AKP活性顯著性升高(p< 0.05)；10 mg·kg-1組AKP的活性顯著性升高(p< 0.05)，見表3。

2.3 4-硝基酚對大鼠肝臟組織結構的影響

圖1為各組大鼠肝臟的顯微結構變化，從中可以看到，對照組肝細胞排列緊密，形態正常(圖1A)。

表2 PNP對大鼠體重、肝臟重及肝臟系數的影響Table 2 Effects of PNP on the body weight, liver weight and liver index of rats

注：數據采用平均數±標準誤(Mean±SEM)表示，n=5

Note：Values are expressed as Mean ± SEM，n=5

表3 PNP對大鼠血清中肝功能標志物的影響Table 3 Effects of PNP on the indicators of liver function in serum of rats

注：數據采用平均數±標準誤(Mean±SEM)表示，n=5。與對照組相比，*p<0.05。

Note: Values are expressed as Mean ± SEM for 5 animals. Compared with control group, *p< 0.05.

與對照組相比，1 mg·kg-1PNP組肝細胞核著色較深，匯管區有大量淋巴細胞浸潤(圖1B)；10 mg·kg-1PNP組肝臟匯管區有大量淋巴細胞浸潤(圖1C)；100 mg·kg-1PNP組中央靜脈有大量淋巴細胞浸潤，肝血竇變寬(圖1D)。

圖2為對照組和100 mg·kg-1PNP組大鼠肝臟的超微結構圖。從中可以看到，對照組肝細胞核呈圓形，細胞核周圍有大量的線粒體和內質網，線粒體完整，內質網排列整齊(圖2A)。與對照組相比，100 mg·kg-1PNP組肝細胞核發生固縮(圖2B)、內質網排列紊亂(圖2C)、出現凋亡小體(圖2D)、線粒體部分內外膜消失和線粒體嵴斷裂(圖2E)。

圖1 PNP處理對大鼠肝臟顯微結構的影響(A)對照組；(B)1 mg·kg-1 PNP組；(C)10 mg·kg-1 PNP組；(D)100 mg·kg-1 PNP組Fig. 1 Effects of PNP on microstructure change in rat liver (A) Control group；(B) 1 mg·kg-1 PNP group；(C) 10 mg·kg-1 PNP group；(D) 100 mg·kg-1 PNP group

圖2 PNP處理對大鼠肝臟超微結構的影響(A)對照組；(B)、(C)、(D)、(E)100 mg·kg-1 PNP組Fig. 2 Effects of PNP on ultrastructure change in rat liver (A) Control group；(B、C、D、E) 100 mg·kg-1 PNP group

2.4 4-硝基酚對大鼠肝臟氧化和抗氧化系統的影響

與對照組相比：H2O2和MDA含量均在1 mg·kg-1組顯著性升高(p< 0.01，p< 0.05，見圖3A、3B)；10 mg·kg-1和100 mg·kg-1組CAT活性均顯著性降低(p< 0.01，p< 0.001，見圖3C)；1、10和100 mg·kg-1組SOD活性均顯著低于對照組(p< 0.001，見圖3D)；10和100 mg·kg-1組GSH含量(p< 0.01，p< 0.001，見圖3E)及GSH-PX活性(p< 0.01，p< 0.05，見圖3F)均顯著性降低。

圖3 PNP處理對大鼠肝臟氧化和抗氧化系統的影響 (A)H2O2，(B)MDA，(C)CAT，(D)SOD，(E)GSH，(F)GSH-PX 注：數值用Mean±SEM表示，n=5，與對照組相比，* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001Fig. 3 Effects of PNP on oxidation and antioxidant system in rat liver (A) H2O2，(B) MDA，(C) CAT，(D) SOD，(E) GSH，(F) GSH-PXNote：Values are expressed by the Mean ± SEM of 5 rats per group．* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001

2.5 4-硝基酚對大鼠肝臟Nrf2相關基因表達的影響

圖4為各組大鼠肝臟的Nrf2、HO-1、NQO1和GCLC mRNA相對表達量的變化。與對照組相比，1 mg·kg-1組的Nrf2(圖4A)、HO-1(圖4B)和NQO1(圖4C)顯著性升高(p< 0.05)，GCLC(圖4D)有升高趨勢(p> 0.05)；Nrf2、HO-1和NQO1在100 mg·kg-1組有升高趨勢，但差異不顯著(p> 0.05)。

3 討論(Discussion)

3.1 4-硝基酚對大鼠體重和肝臟重量的影響

臟器系數一般適用于檢測心、肝、脾、肺和腎等實質性器官，如果臟器系數變小，表明臟器可能出現萎縮和退行性變化；如果臟器系數變大，表明臟器可能出現水腫、充血和增生等病變[14]。本試驗PNP處理沒有引起大鼠體重、肝臟重和肝臟系數發生顯著性變化，說明PNP在本實驗劑量下對大鼠生長沒有顯著性影響。

3.2 4-硝基酚對大鼠血清肝功能的影響

肝臟是動物體物質代謝活動的中心，含有大量酶類。肝臟酶的釋放是反應肝細胞損傷的重要指標。外源化學物質能以肝臟為主要靶器官，促使肝細胞損傷，導致肝臟分泌到血清中的酶類發生變化。本試驗結果顯示，100 mg·kg-1PNP處理組的大鼠血清ALT和AST活性以及TBIL含量顯著性升高，10 mg·kg-1PNP組AKP活性顯著性升高，1 mg·kg-1PNP組大鼠血清AST活性顯著性升高，這一結果與柳成剛等[15]研究的二甲基亞硝胺對大鼠肝損傷的結果一致。我們的研究結果說明皮下注射PNP能夠引起肝臟的功能損傷。

圖4 PNP處理對大鼠肝臟Nrf2及其相關基因的mRNA相對表達量的影響(A)Nrf2 mRNA，(B)HO-1 mRNA，(C)NQO1 mRNA，(D)GCLC mRNA注：數值用Mean±SEM表示，n=5，與對照組相比，* p < 0.05Fig. 4 Effects of PNP on the mRNA expression`levels of Nrf2 and related genes in rat liver (A) Nrf2 mRNA，(B) HO-1 mRNA，(C) NQO1 mRNA，(D) GCLC mRNANote：Values are expressed by the Mean±SEM of 5 rats per group, * p < 0.05.

3.3 4-硝基酚對大鼠肝臟的氧化損傷

動物機體存在兩類抗氧化防御體系，一類是酶促抗氧化系統，包括CAT、SOD、GSH-Px等；另一類是非酶促抗氧化系統，包括谷胱甘肽、維生素E、類胡蘿卜素、微量元素銅、硒等[16]。當外源化學物質進入機體后，會導致機體內自由基和氧化產物增多，使體內的氧化與抗氧化失去平衡，出現生理不適現象。MDA是細胞膜脂質過氧化產物，在抗氧化酶活性降低的情況下，MDA和H2O2含量應該是升高的。本試驗研究發現，1 mg·kg-1PNP處理組大鼠MDA和H2O2含量顯著性升高，但10 mg·kg-1和100 mg·kg-1PNP處理組大鼠的肝臟中GSH含量和CAT、SOD活性均顯著性降低，MDA和H2O2含量均沒有顯著性變化。這可能是由于以下原因：第一，機體的酶系防御系統受到破壞時，非酶系統發揮作用，短時間內并不會造成組織細胞膜損傷；第二，多羥基酚性成分具有捕捉自由基的功能，較高劑量PNP可能通過捕捉細胞內自由基，避免引起細胞膜脂質過氧化損傷，從而降低脂質過氧化產物的產生[17]。

3.4 4-硝基酚對大鼠肝臟Nrf2相關基因表達的影響

近年研究發現，在應激條件下，如血紅素、H2O2、重金屬和內毒素等，均可通過Nrf2 啟動HO-1 的表達表現出明顯的抗氧化作用[18-19]。李梅等[20]研究發現順鉑能顯著誘導腎臟中Nrf2 核轉位, 其下游Ⅱ相解毒酶基因NQO1、GCLC和HO-1 mRNA 表達水平也顯著增加。本試驗也發現1 mg·kg-1PNP處理使大鼠肝臟Nrf2 mRNA表達升高，HO-1和NQO1 mRNA表達水平也升高，變化趨勢基本一致。試驗結果表明，大鼠在應激條件下可能通過啟動Nrf2信號通路來抵抗PNP引起的肝臟氧化損傷。但本試驗中10 mg·kg-1和100 mg·kg-1PNP處理組大鼠Nrf2相關基因的表達均沒有顯著性變化，原因可能是較高劑量PNP引起肝臟毒性，激活了肝臟的其它通路，這還有待進一步研究。

綜上所述，皮下注射1 mg·kg-1PNP引起了大鼠肝臟氧化損傷，機體通過提高Nrf2及其相關基因mRNA的表達水平來抵抗PNP引起的肝臟損傷。100 mg·kg-1PNP組大鼠肝臟的顯微和超微結構有較嚴重損傷，肝臟抗氧化酶活性顯著低于對照組，然而Nrf2通路相關基因的mRNA表達水平卻沒有顯著性升高。由此我們推測，100 mg·kg-1PNP改變了肝臟的正常生理功能，造成肝細胞超微結構病理損傷，導致肝臟毒性。

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