馬氏珠母貝hsp90基因的克隆及芘脅迫對其表達水平的影響

杜俊俏，廖承紅，周海龍，刁曉平2,,*，陳好，李玉虎，王富強

1. 海南大學環境與植物保護學院，?？?570228 3. 海南大學?？谑协h境毒理學重點實驗室，?？?570228 2. 海南大學熱帶生物資源教育部重點實驗室，?？?570228 4. 海南大學農學院，?？?570228

近年來,持久性有機污染物(persistent organic pollutants，POPs)對海洋環境的影響成為近海環境保護面臨的重要問題之一，基于污染物的特性，生物監測成為海洋環境監測中必不可少的工具。隨著研究的深入，分子研究水平更能靈敏的檢測生物體對污染物的反應機制，因此，研究和建立敏感的分子生物標志物，顯得十分必要。

多環芳烴作為一種持久性有機污染物廣泛分布在環境介質中，其中有很多是已知的或是潛在的致癌物質。1979年美國環保署USEPA已將16種PAHs列入優先控制的有機污染物黑名單[1]。芘作為多環芳烴的一種典型4環物質，具有遺傳毒性和致癌性[2]。基于近海PAHs的污染特點以及毒性效應特征，對PAHs的環境污染狀況開展生物監測技術的研究體現出重要的意義。熱休克蛋白(heat shock protein，HSPs)是一類保守的應激蛋白，已被廣泛用作于生物標志物，以反應環境應激和毒性[3]。在熱休克蛋白家族中，研究較為廣的是hsp70和hsp90家族基因。HSP90在保護生物體中起著重要的作用，它能被一系列的壓力因素所調控，如熱或冷應激，高滲應激，餌料匱乏，低含氧量，多氯聯苯(PCB)，砷和重金屬等，并且能用來監測環境有毒物質和環境應激[4-9]。Li等[10]研究發現，脊尾白對蝦(Exopalaemoncarinicauda)肝胰腺組織hsp90的表達量在pH和氨態氮的應激下發生不同的變化；Snyder等[11]研究發現在貽貝(Mytilusgalloprovincialis)和鮑魚(Haliotisrufescens)組織中，hsp70、hsp60、hsp90基因對熱刺激和降解石油的刺激都做出了不同的感應。劉娜[12]研究了苯并芘暴露對菲律賓蛤仔hsp90基因的影響，結果表明在染毒第10天，Hsp90基因的表達量顯著誘導上升。

目前，從雙殼貝類克隆得到的hsp90包括櫛孔扇貝(C.farreri)、菲律賓蛤仔(V.philippinarum)、紋冠蚌(C.plicata)、太平洋牡蠣(C.gigas)等。而關于多環芳烴芘對熱帶海洋重要經濟動物馬氏珠母貝hsp90的表達影響研究鮮見報道。本研究采用RACE技術擴增馬氏珠母貝hsp90基因cDNA全長，對不同組織中hsp90的表達進行半定量和定量分析，同時利用熒光定量PCR方法檢測芘暴露對馬氏珠母貝肝胰腺組織hsp90基因表達的影響，旨在進一步探討hsp90作為分子生物標記物監測海洋環境多環芳烴污染狀況的可能性，為建立海洋環境污染的生態效應監測提供參考依據。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 試劑與儀器

主要實驗試劑芘純度99%(Aladdin公司)；TRIzoL Reagent (invitrogen公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒以及RACE試劑盒，熒光染料試劑盒等均購自大連Takara公司，其他等試劑購于海南天地科技有限公司；其余試劑均為市售分析純藥品。主要儀器為My Cycler thermal cycler(Bio-Rad，USA)，Nano drop2000超微量分光光度計(Thermo，USA)；ABI7500型熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)。

1.2 實驗材料

馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)購于海南省陵水市養殖場，貝齡1.5齡，殼高5.78±0.26 cm，暫養于曝氣海水中，連續充氣，水溫25±1 ℃，pH 8.2，鹽度30‰?；铙w取其鰓組織立即投入液氮中，并轉入-80 ℃冰箱冷凍保存待測。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

總RNA提取時，取50～100 mg保存于-80 ℃鰓組織于研缽上，按照TRIzoL試劑說明書操作提取總RNA，得到的總RNA沉淀用DEPC處理過的無RNase的水溶解分裝保存于-80 ℃。RNA的完整性通過普通1%瓊脂糖電泳，EB染色，觀察。RNA的濃度OD值采用超微量分光光度計檢測，取A260/280=1.8～2.0的樣品進行后續實驗。取1 μg總RNA，按照反轉錄試劑盒(Thermo)的要求反轉，反轉產物cDNA于-20 ℃保存。

1.4 hsp90基因部分片段的克隆

根據NCBI Genbank數據庫中已知的紋冠蚌(C.plicata)(HQ180224.1)、菲律賓蛤仔(V.philippinarum)(HM581640.1)、太平洋牡蠣(C.gigas)(EF687776.1)、櫛孔扇貝(C.farreri) (AY362761.1)等近緣物種序列，使用Primer Premier 5.0和Oligo 7.0，Mega 5.0等軟件設計簡并PCR引物(見表1)。在0.2 mL EP管中加入10×Taq buffer 5 μL，2.5 mM dNTP 4 μL，hsp90-F/hsp90-R(10 μM)各2 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，cDNA模板2 μL，加雙蒸水補足至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；采用Touchdown PCR，5個循環：94 ℃ 30 s，62～54 ℃ 30 s(每個循環降2 ℃)，72 ℃ 45 s；29個循環：94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s；72 ℃ 10 min。

PCR產物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳30 min，經凝膠成像系統確定目的片段后，切下目的條帶稱重，按照Agarose Gel DNA purification Kit 說明書純化 PCR 產物。將純化后的DNA片段與pMD18-T載體連接，并轉化到大腸桿菌DH5α表達，進行藍白斑篩選，并進行菌液PCR驗證轉化成功，將成功轉化的菌液送去上海生工測序。

1.5 hsp90cDNA末端快速擴增反應(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)

為了得到hsp90cDNA全長，根據1.4所得基因片段序列分別設計5’和3’RACE特異性引物。

5’RACE：cDNA采用SMARTer II A primer and 5’CDS primer進行反轉，將反轉錄產物進行100倍稀釋后取2 μL作為模板進行PCR反應，50 μL反應體系中加入1 μL 3’特異性引物hsp90_GSP1(10 μM)與1 μL 5’接頭引物ΜPA primer，反應條件95 ℃預變性1 min，95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25循環，72 ℃ 0 min。所得到的的PCR產物進行稀釋，取2 μL模板作為巢式PCR反應模板，取1 μL 3’特異性巢式引物hsp90_NGSP1(10 μmol·L-1)與5 μL通用引物NΜP(10×)進行巢式PCR，反應條件95 ℃預變性3 min，95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25循環，72 ℃ 10 min。

3’RACE：cDNA采用3’CDS primer A進行反轉錄，所得到的的反轉錄產物經100倍稀釋后取2 μL作為模板進行PCR反應，以5’特異性引物hsp90_GSP2、hsp90_NGSP2分別搭配3’末端通用接頭引物ΜPA primer、NΜP進行PCR反應，反應條件與5’RACE相同。

1.6 hsp90cDNA序列分析和拼接

將所得到的的PCR產物分別進行割膠回收，連接轉化等方法同上。將菌液送上海生工進行測序，應用NCBI Blast在線程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對確認。將序列進行拼接比對，并對所得到的序列以及所對應的蛋白序列的保守區域進行分析。

1.7 hsp90在不同組織中的表達

采集肝胰腺、鰓、外套膜以及閉殼肌、性腺、腹足等組織，分別提取總RNA，采用半定量RT-PCR和熒光定量PCR檢測hsp90在不同組織中的表達量的情況。

1.8 染毒實驗設計

以自然海區所測芘的含量以及預實驗的處理為參照依據，設置染毒濃度組。用一定量丙酮(助溶劑)溶解芘，配成一定濃度的儲備液，設置5個芘處理組(0、4、8、16、32 μg·L-1)進行毒性實驗，以0濃度為對照組，所有實驗處理組均設3個平行。實驗在50 cm×40 cm×30 cm的塑料水槽中進行，每只水槽20 L水，放18只大小均勻的馬氏珠母貝，實驗期間連續通氣，不投餌料，每天換水100%并保證實驗濃度前后一致。實驗開始后分別于染毒1 d、5 d、7 d取樣。取樣時，每個平行組隨機取貝3只，取其肝胰腺組織，立即投入液氮中，之后轉移到-80 ℃冰箱冷凍保存待測。

1.9 芘對馬氏珠母貝肝胰腺hsp90基因表達水平影響的定量檢測

各個濃度與時間的肝胰腺組織樣，RNA提取方式與1.4相同，反轉錄嚴格參照One Step SYBR? PrimeScript? RT-PCR Kit說明書進行，產物于-20 ℃保存待測。用于熒光定量PCR的引物如表1。Qhsp90根據已獲得的cDNA片段(Genbank登錄號KJ010545)設計熒光定量引物目的片段大小149 bp，內參引物gapdh根據已知序列設計(Genbank登錄號AB205404.1)，目的片段大小134 bp。熒光定量PCR反應體系：2×SYBR green 12.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ROX dye II 0.4 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O補足至25 μL。反應條件：94 ℃ 15 s，40個循環：94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s；溶解曲線條件：94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，94 ℃ 1 min，60 ℃ 15 s。

1.10 數據分析

熒光定量PCR所得的數據應用Delta-Delta Ct方法[13]進行相對定量分析，基因的相對表達水平所得實驗數據應用Excel和SPSS19.0軟件進行統計分析。每個實驗樣本重復3次，取平均值。

2 結果(Results)

2.1 馬氏珠母貝hsp90基因cDNA克隆與序列比對分析

利用簡并引物，從馬氏珠母貝鰓組織中擴得了cDNA為743 bp大小的hsp90目的基因部分片段。通過cDNA末端快速擴增技術(RACE)從馬氏珠母貝鰓組織中成功克隆了總長度為2 584 bp的hsp90 cDNA全長序列。其中5’末端非編碼區(untranslation region, UTR)為75 bp，開放閱讀框(open reading frame, ORF)包含2 178 bp，編碼725 aa，分子質量為83.76 KDa，3’末端非編碼區(Untranslation region, UTR)為332 bp。通過在線BLAST比對結果說明，由馬氏珠母貝hsp90基因cDNA序列推導得到的氨基酸序列與其他親緣物種具有高度同源性，且具有5個hsp90家族保守區域以及C端共有氨基酸序列MEEVD(如圖1陰影部分)，由此確認所得序列為馬氏珠母貝hsp90基因的cDNA全長。

應用ClustalW以及MEGA5.0軟件將馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)HSP90氨基酸序列與GenBank中其他多種生物的HSP90氨基酸序列進行比對并利用DNAMAN軟件繪制進化樹(如圖2)。馬氏珠母貝HSP90與不同物種的進化樹分析顯示，HSP90與雙殼類(櫛孔扇貝AAR11781.1、菲律賓蛤仔ADK11101.1、海灣扇貝ABS50431.1、太平洋牡蠣ABS18268.1和近江牡蠣ADL59936.1)匯聚為一個分支，而其它物種如家鼠(NP_034610.1)、斑馬魚(AAC21566.1)、虹鱒魚(NP_001118063.1)和中華蟾蜍(ABD75383.1)等則聚為另一分支。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

圖1 馬氏珠母貝hsp90基因cDNA全長及氨基酸序列注：陰影部分為熱休克蛋白90家族的特征序列；起始密碼和終止密碼子用下劃線指出Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of hsp90 from Pinctada martensiiNote: Heat shock protein 90 family signature motifs were highlighted as shaded regions; the start codon and stop codon were underlined.

圖2 不同物種HSP90進化樹分析(Bootstrap值為1 000，每個分支數值為Bootstrap分析所得百分比)進化樹中的不同物種HSP90s: C.farreri (AAR11781.1), R.philippinarum (ADK11101.1), A.irradians (ABS50431.1), C.gigas (ABS18268.1), C.hongkongensis (ADL59936.1), C.toreuma (AGH32328.1), C.plicata (ADN87332.1), P.undulate (AFZ93093.1), H.asinine (ABR15463.1), T.japonicas (ACA03524.1), M.musculus (NP_034610.1), D.rerio (AAC21566.1), O.mykiss (NP_001118063.1), B.gargarizans (ABD75383.1), G.gallus (CAA49704.1), C.mydas (EMP24483.1), R. sp. ( AAB23369.1), H.sapiens (AAA36026.1), B.dorsalis (AEJ88466.1).Fig. 2 Neighbor-joining phylogenetic tree of protein sequences from Pinctada martensii and other selected species( Aligned sequences were bootstrapped 1 000 times and the numbers at the forks indicate the bootstrap proportions) ：C.farreri (AAR11781.1), R.philippinarum (ADK11101.1), A.irradians (ABS50431.1), C.gigas (ABS18268.1), C.hongkongensis (ADL59936.1), C.toreuma (AGH32328.1), C.plicata (ADN87332.1), P.undulate (AFZ93093.1), H.asinine (ABR15463.1), T.japonicas (ACA03524.1), M.musculus (NP_034610.1), D.rerio (AAC21566.1), O.mykiss (NP_001118063.1), B.gargarizans (ABD75383.1), G.gallus (CAA49704.1), C.mydas (EMP24483.1), R. sp. ( AAB23369.1), H.sapiens (AAA36026.1), B.dorsalis (AEJ88466.1).

2.2 馬氏珠母貝中hsp90基因組織特異性分析

采用半定量和熒光定量PCR檢測hsp90基因在馬氏珠母貝外套膜(mantle)、鰓(gill)、肝胰腺(hepatopancreas)、閉殼肌(adductor muscle)、性腺(gonad)以及腹足(pleopod)中的表達情況。如圖3所示，hsp90基因在不同組織中的表達順序為：性腺>鰓>肝胰腺>外套膜>腹足>閉殼肌。

2.3 芘暴露對hsp90基因表達水平的影響

本研究用芘對馬氏珠母貝進行暴露處理實驗，設置5個不同的處理濃度組(0、4、8、16、32 μg·L-1)，利用熒光定量PCR技術對芘處理后第1天、5天、7天馬氏珠母貝肝胰腺組織hsp90基因表達水平進行分析。圖4-A結果表明，在肝胰腺組織中，染毒后第1 天，低濃度組與對照組相比無明顯差異，但較高濃度組(16、32 μg·L-1)hsp90基因的表達量相比對照組顯著上調(p<0.05)。染毒后第5天，與相同時間對照組比較，誘導現象明顯，高濃度組32 μg·L-1表達量顯著上調(p<0.05)；隨著時間的延長，染毒后第7天，各濃度組hsp90基因表達量逐漸恢復到正常水平。從圖4-B中發現，在芘處理后第1天和第5天，hsp90基因的相對表達水平隨著濃度的升高表現出明顯的劑量-效應關系。

圖3 hsp90基因在不同組織中半定量和熒光定量PCR的結果(M: mantle；G: gill；H: hepatopancreas；AM: adductor muscle; P: plepod)Fig. 3 hsp90 expression level in different tissues by RT-PCR and real-time PCR (M: mantle；G: gill；H: hepatopancreas；AM: adductor muscle; P: plepod)

圖4 馬氏珠母貝肝胰腺hsp90基因相對表達水平隨芘暴露處理時間變化情況(A)和馬氏珠母貝肝胰腺hsp90基因相對表達水平隨芘暴露處理濃度變化情況(B) (*：與對照組比較，p<0.05)Fig. 4 Changes of Pinctada martensii hsp90 gene relative expression level with Pyrene treatment time (A) and changes of Pinctada martensii hsp90 gene relative expression level with pyrene treatment concentration (B) in hepatopancreas (*: compared with the control group, p<0.05)

3 討論(Discussion)

熱休克蛋白(HSPs)是普遍存在的且高度保守的應激蛋白，出現在從細菌到人類的所有生物中。當生物體處于潛在的有害條件時，它們扮演著重要的角色[14-16]。本研究通過RACE技術擴增得到的hsp90基因，其編碼的氨基酸序列與其他近緣物種Blast比對結果可判定擴增所得到的cDNA序列屬于hsp90基因家族，根據它的C-末端MEEVD序列的存在[17]，推定HSP90屬于胞質HSP90家族。馬氏珠母貝HSP90與其他雙殼貝類(如香港巨牡蠣、櫛孔扇貝)、魚類(斑馬魚、虹鱒魚)等物種具有很高的相似性，其中與香港巨牡蠣(Crassostreahongkongensis)相似性為89%，與櫛孔扇貝(Azμmapectenfarreri)相似性為85%，與小家鼠(Musmusculus)相似度80%，與斑馬魚(Daniorerio)相似性79%。

HSP90在細胞中表達豐度很高，甚至在無應激條件下，在多數組織中也占有1%～2%的細胞蛋白總量[18]。它具有多種生物功能，如維持細胞結構完整性、維持類固醇類受體和轉錄因子、糾正蛋白質的錯誤折疊以及參與細胞周期調節、細胞信號傳導、機體免疫調節等重要的生理功能[19-22]。本研究中通過半定量RT-PCR和熒光定量PCR方法檢測了hsp90基因在不同組織中的表達，與其他五種組織相比，在性腺中的表達量是最高的，這與其他研究者的研究結果相類似[23-24]，這可能意味著hsp90基因與生殖器的生長成熟有關。

HSP90與HSP70一樣具有分子伴侶的看家功能，參與細胞調節蛋白的折疊與裝配過程[25]。HSP90s是細胞中最重要的一種多功能應激蛋白且被廣泛研究。在正常的細胞生理活動，如細胞分裂，分化，發育中都能檢測到HSP90的表達。在應激條件下hsp90的表達受到顯著刺激，表明它們的主要功能之一是保護細胞免受損傷[26-27]。本文通過典型多環芳烴芘對馬氏珠母貝采取染毒脅迫實驗，采用熒光定量PCR手段檢測不同濃度不同時間下hsp90基因在馬氏珠母貝肝胰腺組織中的變化情況。

肝胰腺作為雙殼類軟體動物的解毒代謝器官，也是外源物質進入機體后進行生物轉化的主要場所。本研究發現在肝胰腺組織中，hsp90基因對芘脅迫所表現出的基因相對表達水平，主要表現出隨時間的延長先增加后下降的趨勢。在脅迫條件下，hsp90基因的表達上調是對脅迫影響機體所造成的變性蛋白質增多做出的響應機理[28]。在暴露后第1天和第5天，高濃度組hsp90表達水平與對照組相比表現出顯著的上調現象(p<0.05)，這與張俊鴻等研究發現焦爐工高劑量組淋巴水平hsp90水平高于對照組和低劑量組相似[29]。高濃度組引起hsp90顯著上調可能是誘導了細胞色素P450相關系統產生解毒代謝過程，發生氧化應激，致使細胞體內產生過量的氧化自由基ROS，進而誘導hsps基因家族的表達[30]。在本研究中隨著芘暴露時間的延長，hsp90基因表達量逐漸恢復到正常水平，這可能是由于機體逐漸適應環境，體內基本已恢復平衡。芘暴露下hsp90基因上調是生物體自我保護的一種反應機制，研究發現hsp90基因的上調與芘濃度呈現出一定的正相關，這一劑量-效應關系與鄭森林等報道的苯并芘誘導蚯蚓hsp90基因的上調相似[28]。

本文通過設計近緣物種的簡并引物以及RACE手段擴增得到了馬氏珠母貝hsp90基因cDNA全長序列。采用熒光定量PCR檢測發現芘脅迫對馬氏珠母貝hsp90基因的轉錄具有一定的上調作用，熱休克蛋白在環境外源物刺激的情況下所作出的反應是保護機體免受芘脅迫污染的自我保護應答。在芘脅迫馬氏珠母貝中，hsp90基因在肝胰腺中表現出一定的劑量-效應關系， 因此，hsp90基因可作為環境應激與毒性的一種理想的生物標志物。

參考文獻：

[1] Keith L H, Telliard W A. Priority pollutants I-a perspective view [J]. Environmental Science & Technology, 1979, 13(4): 416-423

[2] 鞏宗強, 李培軍, 王新, 等. 芘在土壤中的共代謝降解研究 [J]. 應用生態學報, 2001, 12(3): 447-450

Gong Z Q, Li P J, Wang X, et al. Co-metabolic degradation of pyrene in soil [J]. Chinese Journal of Application Ecology, 2001, 12(3): 447-450 (in Chinese)

[3] 張曉鵬. HSP70的生物學功能新進展 [J]. 國外醫學衛生學分冊, 2002, 29(6): 337-343

Zhang X P. New Developments in the biological function of HSP70 [J]. Foreign Medical Sciences (Section of Hygiene), 2002, 29(6): 337-343 (in Chinese)

[4] Palmisano A N, Winton J R, Dickhoff W W. Tissue-specific induction of Hsp90 mRNA and plasma cortisol response in chinook salmon following heat shock, seawater challenge, and handling challenge [J]. Marine Biotechnology, 2000, 2: 329-338

[5] Pan F, Zarate J M, Tremblay G C, et al. Cloning and characterization of salmon hsp90 cDNA: Upregulation by thermal and hyperosmotic stress [J]. Journal of Experimental Zoology, 2000, 287(3): 199-212

[6] Landais I, Pommet J M, Mita K, et al. Characterization of the cDNA encoding the 90 kDa heat-shock protein in thelepidopteraBombyxmoriandSpodopterafrugiperda[J]. Gene, 2000, 271(2): 223-231

[7] Somji S, Ann Sens M, Garrett S H, et al. Expression ofhsp90 in the human kidney and in proximal tubule cells exposed to heat, sodium arsenite and cadmium chloride [J]. Toxicology Letters, 2002, 133(2-3): 241-254

[8] Cara J B, Aluru N, Moyano F J, et al. Food-deprivation induces HSP70 and HSP90 protein expression in larval gilthead sea bream and rainbow trout [J]. Comparative Biochemistry Physiology B Biochemistry Molecular Biology, 2005, 142(4): 426-431

[9] Wang X H, Kang L. Differences in egg thermotolerance between tropical and temperate populations of the migratory locustLocustamigratoria(Orthoptera:acridiidae) [J]. Journal of Insect Physiology, 2005, 51(11): 1277-1285

[10] Li J T, Han J Y, Chen P, et al. Cloning of a heat shock protein 90 (HSP90) gene and expression analysis in the ridge tail white prawnExopalaemoncarinicauda[J]. Fish Shellfish Immunology, 2012, 32(6): 1191-1197

[11] Snyder M J, Girvetz E, Mulder E P. Induction of marine mollusc stress proteins by chemical or physical stress [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2001, 41: 22-29

[12] 劉娜. 菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)在苯并[a]芘脅迫下差異基因的篩選與分子生物標志物的研究[D]. 青島: 中國海洋大學, 2012

Liu N. Selection of Differential Expression Genes and Study of Molecular Biomarkers of ClamVenerupisphilippinarumExposed to Benzo (a) pyrene [D]. Qingdao: Ocean University of China, 2012 (in Chinese)

[13] Wong M L, Medrano J F. Real-time PCR for mRNA quantitation [J]. Biotechniques, 2005, 39(1): 75-85

[14] Hartl F U. Molecular chaperones in cellular protein folding [J]. Nature, 1996, 381: 571-580

[15] Feder M E, Hofmann G E. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology [J]. Annual Review of Physiology, 1999, 61: 243-282

[16] Kregel K C. Invited Review: Heat shock proteins: modifying factors in physiological stress responses and acquired thermotolerance [J]. Journal of Applied Physiology, 2002, 92: 2177-2186

[17] Ahn H J, Kim S, Nam H W. Molecular cloning of the 82-kDa heat shock protein (HSP90) of Toxoplasma gondii associated with the entry into and growth in host cells [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, 311(3): 654-659

[18] Lai B T, Chin N W, Stanek A E, et al. Quantitation and intracellular localization of the 85 K heat shock protein by using monoclonal and polyclonal antibodies [J]. Molecular and Cellular Biology, 1984, 4: 2802-2810

[19] Holley S J, Yamamoto K R. A role for HSP90 in retinoid receptor signal transduction [J]. Molecular Biology of Cell, 1995, 6(12): 1833-1842

[20] Wiech H, Buehner J, Zimmermann R, et al. HSP90 chaperones protein folding in vitro [J]. Nature, 1992, 358: 169-170

[21] Pandey P, Saleh A, Nakazawa A, et al. Negative regulation of cytochrome C-mediated oligomerization of Apaf-1 and activation of procaspase-9 by heat shock protein 90 [J]. The Embo Journal, 2000, 19(16): 4310-4322

[22] Lange B M, Bachi A, Wilm M, et al. HSP90 is a core centrosomal component and is required at different stages of the centrosome cycle in Drosophila and vertebrates [J]. The Embo Journal, 2000, 19(6): 1252-1262

[23] Jiang S, Qiu L, Zhou F, et al. Molecular cloning and expression analysis of a heat shock protein (Hsp90) gene from black tiger shrimp (Penaeusmonodon) [J]. Molecular Biology Reports, 2009, 36: 127-134

[24] Zhang X Y, Zhang M Z, Zheng C J, et al. Identification of two Hsp90 genes from the marine crab,Portunustrituberculatusand their specific expression profiles under different environmental conditions [J].Comparative Biochemical Physiology C: Toxicology & Pharmacology, 2009, 150(4): 465-473

[25] Pratt W B, Toft D O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones [J]. Endocrine Reviews, 1997, 18(3): 306-360

[26] Csermely P, Schnaider T, S ti C, et al. The 90-kDa molecular chaperone family: Structure, function, and clinical applications. A comprehensive review [J]. Pharmacology & Therapeutics, 1998, 79(2): 129-168

[27] Sreedhar A S, Kalmár é, Csermely P, et al. Hsp90 isoforms: Functions, expression and clinical importance [J]. FEBS Letters, 2004, 562(1-3): 11-15

[28] 鄭森林, 孫鐵珩, 肖紅, 等. 低濃度苯并[a]芘誘導赤子愛勝蚓HSP70和HSP90轉錄上調研究[J]. 應用生態學報, 2008, 29(2): 401-406

Zheng S L, Sun T H, Xiao H, et al. Low dose benzo(a)pyrene up-regulated the transcription of Hsp70 and Hsp90 inEiseniafetida[J]. Chinese Journal of Application Ecology, 2008, 29(2): 401-406 (in Chinese)

[29] 張俊鴻.焦爐工外周血淋巴細胞熱應激蛋白90、60及27的表達與細胞損傷的關系[D]. 太原：山西醫科大學. 2007

Zhang J H. The relation ship between the expression of heat shock protein 90, 60 and 27 and cell damage in Peri Pheral blood of workers exposed to coke oven emission [D]. Taiyuan: Shanxi Medical University, 2007(in Chinese)

[30] Lyons C, Dowling V, Tedengren M, et al. Variability of heat shock proteins and glutathione Stransferase in gill and digestive gland of blue mussel,Mytilusedulis[J]. Marine Environmental Research, 2003, 56 (5): 585-597