吡草醚原藥對大鼠胚胎及胎仔發(fā)育的影響

萬 力, 宋世震, 樊柏林, 劉 瑤, 唐曉蕎, 孫凡中, 劉春霞,*

1. 湖北省疾病預防控制中心 應用毒理湖北省重點實驗室，武漢 430079 2. 武漢科技大學醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，武漢 430065

吡草醚(pyraflufen-ethyl)是一種新型苯基吡唑類苗后除草劑，在小麥以及各種雜草間有很好的選擇性，尤其對豬殃殃等闊葉雜草有很好的防效[1-3]，已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛的運用。作為新型低毒除草劑，吡草醚目前的主要應用形式是以懸浮劑噴灑于田間，可在雜草和小麥表面沉積，最終依靠生物的富集作用以不同的代謝形式進入人群的食物鏈中。加之小麥在農(nóng)產(chǎn)業(yè)中的重要地位，人群的食用同樣會攝入吡草醚或代謝產(chǎn)物[4]。隨著吡草醚在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應用的日益廣泛，其安全性受到研究者的關注，現(xiàn)有的研究資料均表明吡草醚為環(huán)境友好型農(nóng)藥，毒性低，環(huán)境污染小[5]，但國內(nèi)外關于吡草醚毒性的研究資料大多以環(huán)境中植物、小型動物為對象[6-8]，對嚙齒類動物一般毒性及特殊毒性資料尚少，同時致畸試驗是農(nóng)藥登記必不可少的一方面。根據(jù)吡草醚原藥對大鼠急性經(jīng)口LD50>464.00 mg·kg-1，急性經(jīng)皮LD50大于2 150.00 mg·kg-1的試驗結(jié)果，本研究小組依據(jù)《GB 15670-1995 農(nóng)藥登記毒理學試驗方法》[9]設計試驗，旨在通過經(jīng)口染毒受孕大鼠，研究吡草醚對雌鼠及胚胎可能產(chǎn)生的影響，為吡草醚的安全管理提供參考。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 材 料

1.1.1 受試物：吡草醚原藥，白色固體，純度95%。

1.1.2 對照品：陰性對照品為1%羧甲基纖維素鈉溶液，為國產(chǎn)分析純試劑(國藥集團化學試劑有限公司)，陽性對照品為維生素A膠丸(每1萬IU維生素A相當于3 000 μg)，國藥控股星鯊制藥(廈門)有限公司。

1.1.3 實驗動物SPF級wistar大鼠，雌性136只，200～250 g，雄性68只，230～260 g。動物體重差異不超過平均體重的20%，大鼠及飼料均由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物及飼料生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2008-0005。動物質(zhì)量合格證號：No.00008559。

1.1.4 儀器：Motic SMZ168-BL體視顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)。

1.2 劑量設計及動物分組

設3個劑量組，分別為高、中、低劑量組(即464.00、92.80、18.56 mg·kg-1)，1個陽性對照組，給予維生素A(13 000 μg·kg-1)，1個陰性對照組，給予等容量1%羧甲基纖維素鈉溶液。雌鼠交配成功后按體重平均分到各實驗組，每組動物數(shù)約為20只。

1.3 試驗方法

大鼠飼養(yǎng)于本單位SPF級大鼠實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2008-0014。實驗室溫度20～26 ℃，濕度40%～70%。試驗方法按照《GB 15670-1995 農(nóng)藥登記毒理學試驗方法》中“致畸試驗”的規(guī)范方法進行。實驗動物按雌、雄比例為2:1同籠交配，次日清晨陰道涂片檢查雌鼠，發(fā)現(xiàn)精子即確定為受孕第0天(E0)。在雌鼠妊娠第6～15天灌胃給予受試物，連續(xù)共10 d，并分別在受孕第0、6、9、12、15、20天稱孕鼠體重，妊娠第19.5天，處死孕鼠剖腹取出子宮稱重；剖開子宮觀察胎鼠狀況，記錄總著床數(shù)，活胎、死胎和吸收胎數(shù)；逐一檢查胎鼠有無畸形；測量體長(身長+尾長)、體重；再將每窩胎鼠的1/2置于Bouins液中固定，兩周后切片檢查內(nèi)臟是否有畸形；另1/2胎鼠剝皮去內(nèi)臟和脂肪，經(jīng)茜素紅溶液染色，透明后檢查骨骼是否有畸形。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理方法

實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理，計量資料采用方差分析(ANVOA)和Dunnett檢驗，計數(shù)資料采用X2檢驗和確切概率計算法，顯著性檢驗水平α=0.05。

2 結(jié)果(Results)

2.1 一般狀況及對體重的影響

染毒期間，陰性對照組及低、中劑量組大鼠一般狀況良好，未見明顯的異常癥狀和體征；高劑量組和陽性對照組大鼠孕期體重(妊娠后期)及增重降低，與陰性對照組比較，差異有顯著性(p<0.05)，低、中劑量組大鼠孕期體重及增重與陰性對照組比較，差異無顯著性(p>0.05)，結(jié)果見表1。高劑量組孕鼠在灌胃給予受試物期間有兩只死亡，大體解剖可見子宮內(nèi)有胎鼠，各臟器外觀無異常。

2.2 對胚胎發(fā)育的影響

中、高劑量組和陽性對照組胎鼠重量減輕，與陰性對照組比較，差異有顯著性(p<0.01)，高劑量組和陽性對照組胎鼠體長減短，與陰性對照組比較，差異有顯著性(p<0.01)。低劑量組胎鼠體重和體長與陰性對照組比較，差異無顯著性(p>0.05)，陽性對照組外觀畸形主要表現(xiàn)為腦膨出、四肢短等，結(jié)果見表2。

表1 吡草醚原藥對母鼠孕期體重的影響Table 1 Effects on body weight of female pregnant rats

注：*,**分別表示與對照組比較p<0.05，p<0.01。

Note: Compared with control group,*p<0.05,**p<0.01.

表2 吡草醚原藥對胚胎發(fā)育的影響Table 2 Effects on embryo development

注：*,**分別表示與對照組比較p<0.05，p<0.01；N/T：受孕雌鼠個數(shù)/交配成功雌鼠個數(shù)。

Note: Compared with control group,*p<0.05,**p<0.01; N/T：Number of pregnant rats/Number of copulated rats.

2.3 對胎鼠內(nèi)臟和骨骼發(fā)育的影響

中劑量組和陽性對照組胎鼠內(nèi)臟畸形主要表現(xiàn)在腦室發(fā)育不全及異常，與陰性對照組比較，差異有顯著性(p<0.01)；胎鼠骨骼畸形檢查時,陽性對照組和吡草醚原藥中、高劑量組胎鼠骨骼畸形主要表現(xiàn)為頭頂間骨及后頭骨例數(shù)異常、胸骨缺失及鈣化不全，例數(shù)與陰性對照組比較，差異有顯著性(p<0.01)，結(jié)果見表3。

3 討論(Discussion)

目前市場上除草劑種類繁多，化學除草劑多數(shù)是長殘留型，它們在土壤中的殘留期一般可達36個月以上，從而使土壤、地下水、空氣均受到污染。這些影響最終將不同程度地危害人類生存的環(huán)境。有文獻報道，除草劑殘留中毒造成一牧業(yè)發(fā)展有限公司懷孕母羊流產(chǎn)，死亡等，蒙受經(jīng)濟損失。同時除草劑殘留污染環(huán)境和食品對人類健康會造成嚴重的影響，嚴重者可致腫瘤、孕婦流產(chǎn)、女性不孕等疾病[11-12]。所以對新型除草劑致畸作用的研究，對于新型農(nóng)藥的管理及其引起疾病的預防是有重要意義的。

本試驗陽性對照組為維生素A，可導致雌鼠吸收胎率升高，胎仔體重、體長降低，骨骼、內(nèi)臟畸形例數(shù)升高，與對照組比較，差異有顯著性(p<0.05，p<0.01)，有明顯的致畸作用，證明本實驗體系有效。受試物吡草醚原藥可引起中、高劑量組雌鼠的吸收胎率(分別為3.53%和4.00%)升高，可推斷在高于或等于中劑量(92.80 mg·(kg·d)-1)的染毒水平下，胚胎在子宮內(nèi)存活及發(fā)育將明顯受到影響；在高劑量(464.00 mg·(kg·d)-1)染毒水平下，雌鼠體重增長于妊娠第15天(胚胎硬腭閉合期)及以后較陰性對照組明顯降低，同時，中、高劑量組胎仔體重明顯降低，滿足劑量-反應關系，具有一定毒理學意義。胚胎硬腭閉合期是胚胎整體發(fā)育最快速階段[10]，提示臨近硬腭閉合期時，中、高劑量組胚胎于子宮內(nèi)發(fā)育速度受影響；另一方面，在高于或等于中劑量(92.80 mg·(kg·d)-1)染毒水平下，吡草醚可造成胚胎-胎仔的內(nèi)臟發(fā)育、骨骼鈣化不全，但僅有中劑量組表現(xiàn)出胎仔內(nèi)臟畸形例數(shù)升高，低、高劑量組無明顯異常，不滿足劑量-反應關系，故認為沒有毒理學意義；低、中、高劑量組的頭骨異常比例分別為3.23%、16.95%、16.30%；胸骨異常比例分別為7.53%、22.03%、33.70%，呈明顯的劑量-反應關系。有研究表明大鼠骨骼的重要發(fā)育階段為妊娠中期，且與骨化生長有關的因子的高表達時間為E11～E14[13]，但吡草醚是否主要影響大鼠妊娠中期的骨骼發(fā)育，還需要進一步的試驗證明。

表3 吡草醚對胎鼠骨骼和內(nèi)臟發(fā)育的影響Table 3 Effects on bones and organs development of embryo

注：*,**分別表示與對照組比較p<0.05，p<0.01；N/T：各項指標的活胎數(shù)/該組活胎總數(shù)。

Note: Compared with control group,*p<0.05,**p<0.01; N/T：number of lived fetus within index/total number of lived rats within group.

根據(jù)本試驗結(jié)果，吡草醚原藥大鼠致畸試驗未觀察到有害作用劑量為18.56 mg·(kg·d)-1，最小致畸劑量為92.80 mg·(kg·d)-1。吡草醚以及相關代謝產(chǎn)物經(jīng)環(huán)境遷徙或轉(zhuǎn)移最終會進入生活環(huán)境被人群所接觸，此結(jié)果可為確定該除草劑安全接觸限值提供依據(jù)。

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