褐菖鲉肝HSC70基因的環介導等溫擴增技術的建立及在石油污染劑量效應研究中的應用

莫正平，陳 榮,*，黃火清，左正宏

1. 廈門大學環境與生態學院, 近海海洋環境科學國家重點實驗室 廈門 361102 2. 廈門大學生命科學學院，廈門 361102

石油污染是各種海洋污染中發生頻率最高、分布面積最廣、危害程度最大的一種，被稱為海洋環境的超級殺手。我國也面臨著海上重大石油污染問題，國家海洋局公布的2012年海上環境災害和突發事件中，蓬萊19-3油田等溢油事故造成事故海域海水中石油類含量超第三類海水水質標準。事故海域浮游生物群落受到溢油影響，多樣性指數低于背景值，嚴重破壞了海洋生態系統。污染物的危害主要體現為對生物體的毒害作用，因此，利用生物體毒性傷害狀況監測其所處環境，可對污染總體效應進行直觀、綜合的評價[1]。石油水溶性成分(water-soluble fraction，WSF)進入生物體內后會發生生物轉化，一些成分被氧化代謝后形成各種中間代謝物，這些中間代謝物具有很高的生物活性，容易對生物體產生毒性。WSF對魚類的危害的最敏感階段主要是早期發育階段，如魚精子的活性、精卵的受精率、受精卵的孵化率、仔魚的存活率及仔魚生長發育過程等，具體表現為：抑制、畸變、致死等效應[2]。相關研究表明暴露于多環芳烴等石油成分中會影響幼魚發育，從而導致幼魚死亡率急速上升[3]。

熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)，是生物體在受到外界環境脅迫因子(如高溫、低溫、缺氧、病原入侵、污染和饑餓等)刺激下所產生的一類對細胞起保護和修復作用的特殊蛋白[4]。HSPs普遍存在于自然界原核、真核細胞中，分為4個家族——HSP90家族(分子量為83～90 kDa)、HSP70家族(分子量為66～78 kDa)、HSP60家族以及小分子量HSPs家族(12～43 kDa)。HSC70是HSP70家族中組成型的基因，主要參與蛋白質的折疊、解折疊和組配[5]，并且能被外界刺激所誘導[6]。一些研究表明，HSC70對不同污染物有著廣泛反應性[7-11]。暴露在農藥毒死蜱40 d后，鯉魚(CyprinuscarpioL.)肝臟等器官內HSC70表達量顯著上升[12]；重金屬銅和鎘則明顯抑制中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)HSC70基因表達[13]；在24 h急性暴露后，搖蚊(Chironomustentans)幼蟲HSC70基因被壬基苯酚顯著誘導[14]。但石油污染對海洋魚類HSC70的影響鮮見報道。

褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)分布于北太平洋西部，我國產于南海、東海、黃海和渤海，為暖溫性底層魚類。褐菖鲉對污染物相應敏感，適合于作為石油類污染及其生化效應尤其是低劑量效應的監測生物[15]。

環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術是Notomi等[16]建立的一種新穎的核酸擴增技術，具有高特異性、高效率、便捷等特點，在等溫條件下即可高效快速地完成擴增反應，可用于現場的快速檢測。自2000年開發以來，LAMP技術已廣泛應用于細菌、病毒、寄生蟲等病原體的定性檢測及動物胚胎性別的鑒定[17-19]。本文在國內首次將LAMP技術引入海洋環境監測領域，以褐菖鲉為實驗動物，建立LAMP技術檢測海洋魚類HSC70基因的方法，并利用該技術檢測不同濃度WSF暴露后褐菖鲉肝HSC70的表達量，從而為探究HSC70基因的生物功能及作為生物標志物應用于海洋石油污染監測的可行性提供科學依據。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

主要儀器：凈化工作臺(SW-CJ-1FD，蘇州凈化設備工程有限公司)，熒光定量PCR儀(Mx3000p，吉泰生物科技有限公司)，恒溫金屬浴(CHB-A4-9602，杭州博日科技有限公司)，NanoDrop2000 Spectrophotometer(Thermo Fisher公司)，LA-320C實時濁度儀(北京藍譜生物科技有限公司)，PCR儀(Bioer Serves Life公司)，5415R型冷凍離心機(Eppendorf公司)。

主要試劑：Bst DNA聚合酶(NEB公司)，瓊脂糖(西班牙Biowest公司)，MgCl2(Sigma公司)，betaine(Bio Basic公司)，T4 DNA 連接酶 (Fermentas公司)，SYBR Green qPCR Mix (廈門鷺隆生物科技有限公司)，dNTP和DS2000 DNA Marker (東盛生物公司)，Tris和EDTA (上海生物工程公司)，原油 (AM，中油，購自阿根廷)，其它試劑均為國產分析純。

1.2 實驗動物

褐菖鲉購自廈門市第八市場，體長(11.7±1.2) cm，體重(24.79±5.8) g，雌雄不拘。先在清潔沙濾海水中暫養7 d，選取活力好的個體進行污染實驗。實驗過程中如有個體死亡，減少缸內水量確保每只個體占據水體積2 L。

1.3 實驗方法

1.3.1 石油水溶性成分污染實驗

WSF的制備：含油海水儲備母液的制備：將原油(中油，阿根廷)與清潔沙濾海水按體積比1:10 混合，電動低速攪拌機連續攪拌4 h，靜置16 h后通過虹吸法分離出下層水溶相作為儲備母液，置于4 ℃冰箱避光保存，使用前測定其油濃度。水溶相中油濃度的測定采用熒光分光光度法，以國家海洋環境監測中心20-3 油為標準，熒光測定波長Ex = 310 nm，Em = 365 nm。開始實驗時，根據需要用清潔沙濾海水把原油WSF母液稀釋到相應濃度及相應體積。

驗證實驗：實驗設對照組和20、60、180 μg·L-13個不同的濃度組。每組10 條魚，每組設兩個平行，對照組50 L沙濾海水不含原油WSF。用充氣機連續充氣，喂以人工餌料，每天采用靜態半置換法更新相應濃度的含油海水溶液50%。飼養期間水溫17～19 ℃，鹽度22～24‰。暴露后的第1 d取肝臟，置于-80 ℃冰箱保存待用。

劑量—效應實驗：實驗設對照組和25，50，75，100，125，150，175 μg·L-17個不同的濃度組。每濃度組10 條魚，每組設兩個平行，對照組50 L沙濾海水不含原油WSF。其余同驗證實驗。

1.3.2 褐菖鲉HSC70基因的克隆

1.3.2.1 簡并引物的設計：利用NCBI檢索親緣關系相近物種相應的mRNA系列，用DNAMAN和Primer Premier 5.0軟件設計引物。具體引物序列如表1所示。

表1 HSC70基因的簡并引物Table 1 Degenerate primers of HSC70 gene

1.3.2.2 RNA提取及反轉錄：RNA 提取參照TaKaRa公司提供的RNAiso Plus 說明書進行，得到的RNA加入適量DEPC水使其濃度均為1 000 ng·μL-1；反轉錄按照Thermo公司提供的ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit使用說明進行，產物cDNA稀釋5倍，分裝保存于-20 ℃冰箱待用。

1.3.2.3 從模板cDNA中擴增基因序列及T載體克隆

以反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR反應，產物純化后與T載體連接，轉化到大腸桿菌中，克隆得到的片段送至上海英駿公司測序。測序結果經NCBI數據庫比對后，確認為褐菖鲉相關基因的mRNA序列，上傳至NCBI基因數據庫。

1.3.3 實時熒光定量PCR及環介導等溫擴增技術引物設計

根據已登錄GenBank的褐菖鲉HSC70(基因序列號：JX255673) cDNA序列設計real-time PCR引物，利用在線引物設計軟件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設計LAMP 特異引物：FIP、BIP、F3 和B3，對應的引物序列如表2 所示。

表2 熒光定量PCR和環介導等溫擴增方法引物Table 2 Primers of real-time PCR and LAMP methods

1.3.4 環介導等溫擴增定量方法

LAMP反應體系：總體積25 μL，經優化后體系內各試劑含量分別為：8 mmol·L-1Mg2+，0.4 mol·L-1Betaine，1.4 mmol·L-1dNTPs，2.4 μmol·L-1內引物，0.4 μmol·L-1外引物，8 U Bst DNA聚合酶，1×ThermoPol Reaction Buffer，2 μL模板DNA，5 μL dd H2O。反應溫度64 ℃。反應過程可產生焦磷酸鎂乳白色沉淀，其含量與DNA含量成正比，因此利用濁度儀進行定量檢測。

LAMP標準曲線的測定：以F3和B3(表2)為引物進行PCR反應，瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物，即得到LAMP反應的DNA標準品，利用NanoDrop2000分光光度計測定其DNA濃度，根據公式計算拷貝數：

其中質量——DNA標準品的質量濃度，ng·μL-1；分子量——DNA標準品的平均分子量=堿基數×660道爾頓/堿基，g·mol-1；阿伏伽德羅常數，copies·mol-1。

10倍稀釋標準品，配制25 μL體系標準系列。利用LA-320C 實時濁度儀測定。實時濁度儀每6 s自動測定一次濁度，以濁度達到0.1時作為陽性判定標準，記錄反應所需時間。

1.3.5 實時熒光定量PCR方法

配制10 μL real-time PCR反應體系，以GAPDH為內參，在熒光定量PCR儀上設置反應程序：95 ℃熱啟動變性2 min，進行40個循環(95 ℃變性20 s，63 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，并在延伸階段之后設置讀值溫度83 ℃讀值20 s)，收集FAM/Sybr 熒光信號。

1.4 數據統計分析

LAMP檢測結果采用Microsoft Excel和SPSS 17.0軟件處理，real-time PCR的檢測結果用Microsoft Excel、Rest 軟件分析處理，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用Origin 8.0軟件繪圖。所有結果均用6個平行樣的平均值±標準誤差表示，實驗組與對照組間數據的比較采用單尾t檢驗分析顯著性差異。p<0.05為顯著差異；p<0.01 為極顯著差異。

2 結果(Results)

2.1 HSC70的環介導等溫擴增定量方法的建立

LAMP標準系列在擴增過程中，濁度值隨著時間的增加而增大，由圖1可以明顯觀察到標準系列濁度值到達閾值0.1所需的反應時間隨著模板含量的增加而逐漸減少。曲線1～6分別表示含有模板濃度依次為 0、4.77×105、4.77×106、4.77×107、4.77×108、4.77×109copies·μL-1的標準系列擴增變化趨勢。

圖1 HSC70擴增曲線Fig. 1 Amplification curves of HSC70

以標準品拷貝數對數值為橫坐標，濁度儀反應達到閾值所需時間為縱坐標，繪制LAMP標準曲線，如圖2所示。

圖2 環介導等溫擴增定量方法反應標準曲線Fig. 2 Standard curve of quantitative LAMP method

2.2 環介導等溫擴增定量方法的可行性

原油WSF暴露1 d后取褐菖鲉肝臟，用LAMP和real-time PCR技術同時測定肝HSC70 mRNA 的表達量，結果如圖3和圖4所示，LAMP檢測結果與real-time PCR檢測結果基本一致。由圖3可知，原油WSF暴露1 d后，褐菖鲉肝臟中HSC70 mRNA 表達量有明顯的上調趨勢，其中20 μg·L-1濃度組為顯著增加，為對照組的1.38倍，之后隨著WSF濃度升高，HSC70 mRNA表達量下降，60 μg·L-1濃度組和180 μg·L-1濃度組則沒有顯著性增加，只是略高于對照組。

圖3 WSF暴露1 d后褐菖鲉肝HSC70 mRNA 表達量的變化(LAMP)Fig. 3 The expression of HSC70 mRNA in the liver of S. marmoratus after exposure to WSF for 1 day (LAMP) (n=6; *p<0.05)

圖4 WSF暴露1 d后褐菖鲉肝HSC70 mRNA 表達量的變化(real-time PCR)Fig. 4 The expression of HSC70 mRNA in the liver of S. marmoratus after exposure to WSF for 1 day (real-time PCR) (n=6; * p<0.05)

2.3 石油WSF影響HSC70基因表達的劑量—效應關系

WSF暴露5 d后，利用LAMP定量測定HSC mRNA水平，結果如圖5所示。褐菖鲉肝HSC70 mRNA 表達量在50 μg·L-1組即有顯著性增加，并在75 μg·L-1時達到最高值。而后HSC70 mRNA水平逐漸下降，除了100 μg·L-1濃度組仍表現為顯著性誘導外，其他濃度組雖然較對照組有所誘導但沒有顯著性差異。

圖5 WSF誘導5 d后褐菖鲉肝HSC70 mRNA 表達量的變化Fig. 5 The expression of HSC70 mRNA in the liver of S. marmoratus after exposure to WSF for 5 days (n=6; * p<0.05; ** p<0.01)

3 討論(Discussion)

LAMP技術已經在病毒、寄生蟲等定性檢測方面得到廣泛應用，但在定量方面的應用研究報道不多。有研究表明，LAMP技術已經應用于人類星狀病毒和某些微生物的定量檢測中[20-21]，但在毒理學方面的應用目前未見報道。在本研究中，褐菖鲉肝HSC70標準品拷貝數對數值與LAMP反應達到閾值所需時間表現出良好的線性相關性，相關系數達到0.9985，表明利用LAMP技術進行定量具有較高的精確性。同時利用LAMP技術和real-time PCR技術對WSF污染1 d后的褐菖鲉肝臟HSC70 mRNA的表達量進行定量檢測，結果表明兩種定量技術測定結果基本一致，說明LAMP技術可以應用于實際樣品檢測。與real-time PCR相比較，LAMP法具有無法比擬的簡便快速、高度靈敏特異、成本低廉等優點，因此實際應用中更具優勢。

熱休克蛋白對污染物響應敏感，以往關于HSC70對重金屬的響應研究開展較多[22-24]，近年逐漸關注有機污染物的影響，如烴類物質可以顯著誘導生物體內HSPs mRNA 的表達[25]。在本研究中，褐菖鲉暴露于50 μg·L-1WSF 5 d后，HSC70基因就被顯著誘導，在75 μg·L-1下達到最大值，而后隨WSF濃度增加逐漸下降至對照組水平。與之變化趨勢類似的，以不同濃度的苯并(а)芘(0、5、50、500 μg·L-1)處理搖蚊幼蟲，5 μg·L-1的苯并(а)芘即可顯著誘導搖蚊幼蟲體內HSC70 基因，隨著濃度升高，HSC70 mRNA表達量下降，但仍被顯著誘導[14]。此外，以不同濃度的敵百蟲處理近江牡蠣，發現極低濃度的敵百蟲(0.1 μg·L-1)仍然能夠誘導鰓中HSC70 基因顯著高表達，表明HSC70 對敵百蟲的刺激反應非常靈敏[26]。這都說明HSC70基因對污染物反應比較敏感，而且可引起HSC70顯著誘導的污染物濃度均較接近環境濃度，同時野外調查研究也發現，長期的海洋重金屬污染仍然可以顯著誘導HSC70蛋白[27]，因此HSC70有望作為生物標志物用于監測海洋環境污染[28]。

暴露在WSF環境下，褐菖鲉肝HSC70的誘導表達可以認為是生物體克服不良環境和防止中毒的一種適應性改變，而誘導量的下降則反映了生物體可能因污染的毒性作用而產生了中毒反應，導致生物體在高濃度暴露后調節能力下降[29-30]。雖然本研究中并未出現HSC70基因表達被抑制的效應，但可以看到較高濃度WSF污染下，HSC70表達量逐步下降至對照組水平。若進一步增加污染物濃度或延長暴露時間，就有可能抑制HSC70基因的表達。

綜合以上分析，作為一種快速、新穎的核酸擴增生物技術，LAMP定量測定褐菖鲉肝HSC70基因結果可靠，在海洋石油污染監測中應用中具有可行性和優越性。褐菖鲉肝HSC70對石油WSF污染響應較為敏感，在短期暴露中低濃度下即被顯著誘導，有望海洋石油污染早期預警分子。但這還需進一步研究加以確定。

致謝：感謝廈門大學生命科學學院王重剛教授及國家海洋局第三海洋研究所張玉生研究員等給予的大力支持和幫助。

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