應用黑斑蛙胚胎測試化學品發育毒性的方法

蘇紅巧，付旭鋒，趙亞嫻，樓欽欽，秦占芬

中國科學院生態環境研究中心環境化學和生態毒理學國家重點實驗室，北京 100085

化學物質對生物和人體生長發育的影響廣受關注[1]。1991年美國材料與測試協會(American Society for Testing and Materials, ASTM)頒布檢測化學物質發育毒性的《非洲爪蟾胚胎致畸試驗(Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus, FETAX)導則》，經過多次修訂，該方法已用于化學物質和環境樣品發育毒性的測試[2]。ASTM對FETAX試驗進行解釋：盡管該方法是以非洲爪蟾為試驗生物建立的，但是各地可以根據當地管理或其他方面的需要，選擇當地的蛙科或蟾蜍科動物種作為試驗生物開展試驗，但試驗方法需要根據具體種屬的胚胎生物學特性做些調整。

黑斑蛙是我國最為常見的一個蛙種，屬蛙科蛙屬，幾乎分布于全國各地。多年來被用作生物學研究和教學的實驗材料[3]。近年來，黑斑蛙逐漸被用作環境污染檢測和生態毒理學的試驗生物。應浩等[4]用黑斑蛙胚胎檢測了河南新鄉段衛河水的污染情況。汪學英等[5]和盧祥云等[6]分別研究了重金屬和農藥對黑斑蛙胚胎的毒性作用。任東凱等[7]研究了新型污染物全氟辛烷磺酸鹽及其替代品對黑斑蛙胚胎的發育毒性。這些研究為化學品管理、農藥的合理使用及兩棲動物保護提供了科學依據。但是這些現有研究報道中，對胚胎階段、暴露溫度等試驗條件的選擇比較混亂，這大大降低了實驗室之間數據的可比較性。另外，所用到的試驗生物-黑斑蛙胚胎大多來自于野外采集，受自然界黑斑蛙產卵季節的限制。采集到的試驗材料也存在污染背景不明、遺傳背景不清等諸多問題，導致實驗結果不確定性增加、重現性降低等。20世紀80年代初，OECD等國際組織在對一些測試方法進行標準化的同時，十分注重供試生物的實驗動物化工作[8]。近三年來，我們實驗室將野生黑斑蛙引入實驗室，開展了較為系統的實驗動物化及相關的生物學研究，目前黑斑蛙已具備作為試驗生物的條件，可用于化學品的毒性測試[9]。

鑒于此，本文擬參照FETAX試驗方法，使用實驗室孵育的黑斑蛙胚胎為試驗材料，確定黑斑蛙胚胎發育毒性試驗方法的條件：選擇五氯酚、視磺酸、氯化鎘、重鉻酸鉀四種典型的具有胚胎毒性的化學物質為測試物，研究黑斑蛙胚胎對化學物質的敏感性；選擇五氯酚為測試物，研究黑斑蛙胚胎發育毒性試驗的重復性。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器設備：兩棲動物誘導繁育設備(本實驗室研發)；體式顯微鏡(XTL0745，重慶光電儀器有限公司)；脫色搖床(TS-1，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；90 mm和150 mm玻璃培養皿(北京玻璃集團臺州博美玻璃儀器廠)；巴斯德吸管(海門市如意橡塑制品廠)。

試劑：五氯酚(CAS NO. 87-86-5, Dr.Ehrenstorfer)；視磺酸(97%, CAS NO. 302-79-4, J&K)；氯化鎘、重鉻酸鉀(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；促黃體素釋放激素(LHRH, Sigma)；人絨毛膜促性腺激素(HCG, 煙臺北方制藥有限公司); 半胱氨酸(北京索萊寶科技有限公司); MS-222 (Sigma)。

1.2 試驗生物

本實驗室養殖的成年黑斑蛙，飼養在水陸兩棲的玻璃缸中，每日喂食面包蟲一次，清洗玻璃缸。水溫24±1℃，明暗光周期為12 h:12 h。

成年雌蛙皮下注射20 μg LHRH和300 IU HCG，成年雄蛙皮下注射20 μg LHRH和200 IU HCG，放入兩棲動物誘導繁育設備中，置于黑暗陰涼處，誘導其抱對產卵。

用10 cm×20 cm整理盒收集受精卵，2%(W/V)的半胱氨酸(pH 7.8～8.0), 在脫色搖床上進行脫膜。脫膜過程分兩次，第一次持續15～20 min，至卵團分離成單個的受精卵。用去氯自來水沖洗3次后加入2%半胱氨酸進行第二次脫膜，大約持續10～15 min，至受精卵外層膜脫落后，用去氯自來水漂洗5次以上，倒入150 mm培養皿中。

體式顯微鏡下觀察胚胎，選擇發育正常的Gosner 8期(中囊胚期)至Gosner 10(原腸胚早期)的胚胎[10]進行暴露試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 限度試驗和預試驗

受試化學品的最大水溶解度大于或等于100 mg·L-1時，以100 mg·L-1濃度進行限度試驗；受試化學品的最大水溶解度小于100 mg·L-1時，則在最大溶解度下進行限度試驗。同時設空白對照，如果使用助溶劑則需要增設溶劑對照組，其中溶劑的濃度與限度濃度處理組中溶劑濃度相同。助溶劑的體積濃度不得超過0.1‰。限度濃度下96 h暴露，胚胎沒有出現死亡和畸形，則不再進行下一步試驗，認為該受試化學品的96 h半數致死濃度(median lethal concentration, LC50)和96 h半數致畸濃度(median teratogenic concentration, TC50)大于限度濃度。

預試驗設置間距較大的4～5個濃度組配制試驗溶液，按幾何級數間距選擇濃度，確定胚胎96 h最低全致死濃度和最高全存活濃度，作為正式試驗的上下限濃度。如果數據不充分，無法確定正式試驗所需要的濃度范圍，則重新選擇一個濃度范圍進行預試驗。

1.3.2 正式試驗

通過一次或兩次預試驗，確定合適的濃度范圍，以一定級差間距設置5～7個濃度組，濃度間隔系數應小于或等于2.2。四種受試化合物暴露胚胎的正式試驗濃度范圍分別為五氯酚：71.0～810.0 μg·L-1；視磺酸：4.5～76.9 μg·L-1；氯化鎘：2.0～8.6 mg·L-1；重鉻酸鉀：29.6～225 mg·L-1。同樣，設空白對照組，如果使用助溶劑則需要增設溶劑對照組，其中溶劑的濃度與最高濃度處理組溶劑濃度相同。溶劑的體積濃度不超過0.1‰。每個處理組設置2個平行。

暴露試驗在90 mm培養皿中進行，每個培養皿加入40 mL暴露液，用巴斯德吸管隨機放入黑斑蛙胚胎25只。置于恒溫培養箱中，暴露溫度為25±1 ℃，明暗光周期為12 h:12 h。為避免視磺酸分解，視磺酸暴露層用黑色袋子遮蓋。每隔24 h換液，清除死亡個體，記錄死亡數。暴露結束時，記錄每個培養皿胚胎死亡數和畸形的數目(存活胚胎)。存活胚胎用100 mg·L-1的MS-222處理后，再用10%的福爾馬林固定，立即測量頭-尾長度。如果胚胎呈弧形，則沿著胚胎的外形進行測量。

1.4 統計分析

詳細登記每個培養皿中胚胎的死亡、畸形和生長情況。以受試化學品濃度的對數值為自變量(x)，以相應濃度下胚胎死亡/畸形的幾率值為因變量(y)，采用SPSS 16.0數據處理軟件，使用Probit進行回歸分析，計算LC50值、TC50值及其95%置信限，計算致畸指數(teratogenic index, TI)值(TI = 96 h-LC50/96 h-TC50)。如所得數據不適合計算TC50，則記錄受試濃度下的胚胎畸形數。胚胎體長數據在p=0.05水平，用T-檢驗確定最小抑制生長濃度 (minimum concentration to inhibit growth, MCIG)。

如果試驗數據不適于用標準方法計算LC50和TC50，可用不引起死亡/畸形的最高濃度和引起100%死亡/畸形的最低死亡濃度的幾何平均值估算LC50、TC50。

變異系數= (標準偏差SD/平均值MN)×100%

2 結果(Results)

2.1 四種受試化合物的胚胎發育毒性

四種受試化合物對黑斑蛙胚胎的半數致死濃度LC50、半數致畸濃度TC50、致畸指數(TI) 及最小抑制生長濃度(MCIG) 如表1所示。五氯酚、視磺酸、氯化鎘和重鉻酸鉀對黑斑蛙胚胎的LC50分別為572.3 μg·L-1、54.8 μg·L-1、6.8 mg·L-1和97.5 mg·L-1。五氯酚、視磺酸和氯化鎘對黑斑蛙胚胎的TC50分別為246.5 μg·L-1、18.7 μg·L-1和3.4 mg·L-1，TI分別為2.3、2.9和2.0，MCIG分別為160.0 μg·L-1、10.1 μg·L-1和2.4 mg·L-1。重鉻酸鉀也導致黑斑蛙胚胎發育畸形，但在暴露結束之前已經死亡，故未計算出TC50。

各濃度五氯酚暴露黑斑蛙胚胎24 h后導致明顯的畸形，如圖1所示：圖中a為對照組胚胎，b、c、d分別是160、800、4 000 μg·L-1五氯酚暴露組胚胎。與對照組胚胎相比，160、800、4 000 μg·L-1暴露組對胚胎的生長出現明顯的抑制現象，且隨著暴露濃度升高，抑制作用明顯，證明五氯酚具有抑制黑斑蛙胚胎生長的作用。

黑斑蛙胚胎暴露視磺酸試驗結束時，產生的各種畸形如圖2所示。從圖中可以看出，視磺酸導致胚胎全身各部位的畸形現象。

表1 四種受試化合物對黑斑蛙胚胎的LC50、TC50、TI 和 MCIGTable 1 LC50, TC50, TI and MCIG values of four test substances for Pelophylax nigromaculatus embryos.

注：*方括號內數據為該終點指標的95%置信區間。

Note: *Data in the square brackets indicate the 95% confidence interval of the corresponding endpoint.

圖1 五氯酚暴露24 h的黑斑蛙胚胎(a: 對照組，b-d: 處理組)Fig. 1 Pelophylax nigromaculatus embryos exposed to pentachlorophenol for 24 h

圖2 視磺酸暴露的黑斑蛙胚胎(a: 對照組，b-f: 處理組)Fig. 2 Pelophylax nigromaculatus embryos exposed to retinoic acid

除了上述的致死、致畸及抑制生長的作用外，試驗過程中發現暴露氯化鎘、五氯酚和視磺酸引起黑斑蛙胚胎運動行為異常，主要表現在高濃度暴露組胚胎游動遲緩、對外界刺激無反應等。

2.2 黑斑蛙胚胎發育毒性試驗方法的重復性

選取五氯酚分別暴露來自3對不同成蛙的黑斑蛙胚胎，研究黑斑蛙胚胎發育毒性試驗方法的重復性，結果如表2所示：發育毒性終點指標LC50、TC50、TI及MCIG的變異系數分別為12.6%、18.0%、23.0%和18.6%。

表2 三次重復試驗中五氯酚對黑斑蛙胚胎的LC50、TC50、TI 、MCIG及相應的變異系數Table 2 LC50, TC50, TI and MCIG values and their variable coefficients of pentachlorophenol for Pelophylax nigromaculatus embryos in three repeat tests.

注：LC50、TC50及MCIG的單位均為μg·L-1。

Note: Units of LC50、TC50and MCIG are μg·L-1.

3 討論(Discussion)

化學品的生態毒理學評價中，根據需求選擇適當的試驗動物尤為重要。兩棲動物進行體外受精，產卵量大，胚胎發育肉眼可見，是良好的胚胎發育毒性評價的生物模型。非洲爪蟾胚胎致畸試驗(FETAX)可以簡便、快速檢測化學品的發育毒性，現已廣泛的用于單一化學品、環境樣品發育毒性的檢測中[11-12]。但是生態系統的敏感種和優勢種具有地域差異，使用本土生物種代替國際通用種用于各國的化學品毒性評價是目前的環境管理的趨勢和要求[13-14]。2010年我國環境保護部頒布《新化學物質環境管理辦法》[15]，明確要求新化學物質申報時，所提供的生態毒理學特性測試報告中必須包括用我國本土生物種獲得的毒性數據。因此，本文選擇我國的本土兩棲動物種黑斑蛙為試驗生物，參考FETAX方法建立一種評價化學物質胚胎發育毒性的方法。

3.1 黑斑蛙胚胎發育毒性試驗方法條件的選擇

近年來，很多研究者選擇黑斑蛙胚胎進行環境污染檢測和生態毒理學的研究。但是由于實驗條件的不一致導致實驗室之間數據缺乏可比較性。在胚胎發育階段的描述方面，有參照Gosner分階段法的[4,7]，也有參照王應天[16-17]、朱冶平[6,18]分階段法的。其中Gosner分階段法是國際通用的方法，趙爾宓[19]對此方法有過詳細介紹。在黑斑蛙胚胎發育毒性研究中，建議采用Gosner的分階段法。對于胚胎暴露的起始階段，有的文章未指明[5,20]，有的則暴露幾個不同的發育階段[16-17]。參照FETAX方法標準，應該以囊胚中期至原腸胚早期胚胎開始暴露，至胚胎發育完成階段結束。因為囊胚中期之前暴露，可能導致胚胎卵裂異常，而原腸胚早期之后的胚胎已經開始了器官發育。胚胎暴露的溫度，20～26 ℃的都有研究者選用。黑斑蛙胚胎的發育會受到溫度和密度變化的影響，本文選擇胚胎暴露溫度為25±1 ℃，90 mm培養皿，40 mL培養液，保證在96 h時完成整個胚胎發育過程到達Gosner 25階段。如果實驗條件無法滿足此要求，則需要根據胚胎發育階段決定實驗的起始與終止。

3.2 黑斑蛙胚胎發育毒性評價終點指標的選擇

對于胚胎發育毒性的評價，國內研究主要是以半數致死濃度和半數致畸濃度為評價終點。致畸指數(TI)則可用于評價化學品的潛在致畸毒性，當TI值≥2時，表示該化學品具有較大的致畸性[21]。試驗結果顯示，五氯酚、視磺酸、氯化鎘的致畸指數分別為2.3、2.9和2.0，表明這三種物質對黑斑蛙胚胎的致畸作用明顯。化學品對胚胎的生長抑制作用是發育毒性的一個重要方面，所以最小抑制生長濃度(MCIG)也是一個重要指標。MCIG是指暴露結束后，測量各濃度暴露組胚胎頭-尾長度，通過統計分析，得出受試化學品抑制胚胎生長的最低濃度。本文研究顯示，五氯酚、視磺酸和氯化鎘的MCIG分別為160.0 μg·L-1、10.1 μg·L-1和2.4 mg·L-1。

半數致畸濃度TC50只是對于導致畸形的測試物有效，如本文中檢測的重鉻酸鉀，在試驗暴露結束時，存活胚胎并無明顯的畸形，從而未能計算TC50和TI兩個指標。對于胚胎畸形的辨別，不同的試驗人員可能會做出不同的判斷。因此，為了增加實驗室之間數據的可重復性，應在以后的研究中積累黑斑蛙胚胎畸形的數據，繪制黑斑蛙胚胎畸形圖譜。

此外，化學品可能會對兩棲動物胚胎的運動行為產生影響。本文選擇的氯化鎘、五氯酚和視磺酸暴露導致胚胎游動緩慢，所以胚胎的游動行為也可以作為胚胎發育毒性的評價指標，這有待以后更多的探索。總之，黑斑蛙胚胎發育試驗從半數致死濃度LC50、半數致畸濃度TC50、致畸指數TI及最小抑制生長濃度MCIG等幾個終點指標，可以很好地評價化學品的發育毒性。同時，以此試驗為基礎，還可以開發更多的終點指標，以更好地進行毒性評價。

3.3 黑斑蛙胚胎對胚胎毒物的敏感性

視磺酸是一種生物內源信號分子，在胚胎發育過程中起重要作用，但是過量的視磺酸會導致胚胎發育畸形[22-23]，被認為是一種典型的致畸劑。五氯酚是一種高效價廉的除草劑、殺蟲劑和消毒劑。研究顯示，五氯酚能引起非洲爪蟾、魚類、鼠類胚胎發育畸形[24-26]。重金屬離子是環境中主要的污染物之一，具有很強的生物毒性作用[27-28]。鎘(Cd)和鉻(Cr)是兩種常見的重金屬，二者的胚胎發育毒性已有諸多研究[29-30]。本文研究結果顯示，這四種化學物質對黑斑蛙胚胎均具有明顯的發育毒性。

收集文獻中這四種化學物質對非洲爪蟾胚胎發育毒性的數據(表3)，與本文中對黑斑蛙胚胎毒性的數據比較發現：對于五氯酚，比較其致畸指數TI，非洲爪蟾胚胎更敏感些，而從最小抑制生長濃度MCIG看，兩類胚胎的敏感性相當；比較氯化鎘和重鉻酸鉀對兩類胚胎的LC50和TC50，發現兩類胚胎對這兩種化學品的致死敏感性相當，致畸敏感性則非洲爪蟾胚胎比較強；而視磺酸對非洲爪蟾胚胎的LC50、TC50和MCIG都明顯高于對黑斑蛙的相應指標，顯示黑斑蛙對視磺酸胚胎的致死、致畸作用和生長抑制作用更敏感。鑒于上述黑斑蛙胚胎和非洲爪蟾胚胎對不同化學品敏感性的差異，在我國化學品管理中，選擇本土黑斑蛙胚胎進行發育毒性評價更為合理。

表3 四種受試化合物對非洲爪蟾胚胎的LC50、TC50、TI 和 MCIGTable 3 LC50, TC50, TI and MCIG values of four test substances for Xenopuslaevis embryos

3.4 黑斑蛙胚胎發育毒性試驗方法的重復性

不同的生物體存在個體差異，所以不同親代蛙的子代質量往往會有差異，從而對化學物質毒性的敏感性也有所不同。Bantle等對FETAX試驗的重復性進行了研究[33]，發現剔除離群值后，LC50的變異系數范圍為1.8%～40.8%；TC50的變異系數范圍為3.5%～31.6%；TI的變異系數范圍為1.3%～54.1%；MCIG的變異系數范圍為0%～119.7%。本文以五氯酚為測試物，進行的黑斑蛙發育毒性重復性試驗結果發現，終點指標LC50、TC50、TI及MCIG的變異系數分別為12.6%、18.0%、23.0%和18.6%，這些值落在FETAX試驗變異系數范圍之內，顯示黑斑蛙胚胎發育毒性試驗的重復性與FETAX相當，可以用于化學品的毒性測試。

總之，本文參考FETAX試驗方法，建立了一種以本土黑斑蛙胚胎為試驗材料的評價化學品胚胎發育毒性的方法，與FETAX比較具有相當的或差異的敏感性，同時與FETAX試驗的重復性相當。顯示該方法可用于我國化學品的毒性評價，為我國的化學品管理提供技術支持。

參考文獻：

[1] Colborn T, Vom Saal F S, Soto A M. Developmental effects of endocrine-disrupting chemicals in wildlife and humans [J]. Environmental Health Perspectives, 1993, 101(5): 378-384

[2] American Society for Testing and Materials (ASTM). ASTM E1439-98 Standard Guide for Conducting the Frog Embryo TeratogenesisAaasy-Xenopus(FETAX) [S]. Philadelphia: Annual Book of ASTM Standards, 2004

[3] 楊安峰, 動物學. 脊椎動物學[M]. 北京大學出版社: 1992: 109

[4] 應浩, 陳曉萍, 陳曉虹. 河南新鄉段衛河水對黑斑側褶蛙早期胚胎發育的影響[J]. 四川動物, 2008, 27(5): 878-880

Ying H, Chen X P, Chen X H. Effect of Weihe River on early embryonic development ofPelophylaxnigromaculata[J]. Sichuan Journal of Zoology, 2008, 27(5): 878-880 (in Chinese)

[5] 汪學英, 盧祥云, 李春梅, 等. 重金屬離子對黑斑蛙胚胎及蝌蚪的毒性影響[J]. 四川動物, 2001, 20(2): 59-61

Wang X Y, Lu X Y, Li C M, et. al. Toxicity of heavy metal irons to embryos and larvae ofRananigromaculata[J]. Sichuan Journal of Zoology, 2001, 20(2): 59-61 (in Chinese)

[6] 盧祥云, 陳海波, 韓曜平. 幾種農藥對黑斑蛙胚胎及蝌蚪的毒性[J]. 四川動物, 2002, 21(2): 84-85

Lu X Y, Chen H B, Han Y P. Poisonous effect of some common pesticides on embryo and tadpole ofRananigromaculata[J]. Sichuan Journal of Zoology, 2002, 21(2): 84-85 (in Chinese)

[7] 任東凱, 蘇紅巧, 劉芃巖, 等. 全氟辛烷磺酸鹽 (PFOS) 及其替代品對兩棲類胚胎的發育毒性[J]. 生態毒理學報, 2012, 7(5): 561-564

Ren D K, Su H Q, Liu P Y, et al. Developmental toxicity of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and its substitutes to amphibian embryos [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2012, 7(5): 561-564 (in Chinese)

[8] 沈英娃, 王宏, 盧玲. 化學品環境管理與水生實驗動物[J]. 中國比較醫學雜志, 2004, 14(1): 53-56

Shen Y W, Wang H, Lu L. Environmental management of chemicals and aquatic laboratory animals [J]. Chinese Journal of Comparative Medicine, 2004, 14(1): 53-56 (in Chinese)

[9] 蘇紅巧, 張銀鳳, 秦占芬, 等. 黑斑蛙與非洲爪蟾蝌蚪急性毒性試驗方法敏感性的比較[J]. 生態毒理學報, 2013, 8(5): 785-790

Su H Q, Zhang Y F, Qin Z F, et al. Comparison of the sensitivity ofRananigromaculatawith Xenopus laevis in tadpole acute toxicity test [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2013, 8(5): 785-790 (in Chinese)

[10] Gosner K L. A simplified table for staging anuran embryos and larvae with notes on identification [J]. Herpetologica, 1960, 16(3): 183-190

[11] Prati M, Biganzoli E, Boracchi P, et al. Ecotoxicological soil evaluation by FETAX [J]. Chemosphere, 2000, 41(10): 1621-1628

[12] Vrskova D, Modra H. Evaluation of the developmental toxicity of 2-phenoxyethanol and clove oil anaesthetics using the Frog Embryo Teratogenesis Assay:Xenopus(FETAX) [J]. Veterinarni Medicina, 2012, 57(5): 245-250

[13] Mortensen A S, Kortner T M, Arukwe A. Thyroid hormone-dependent gene expression as a biomarker of short-term 1, 1-dichloro-2, 2-bis (p-chlorophenyl) ethylene (DDE) exposure in European common frog (Ranatemporaria) tadpoles [J]. Biomarkers, 2006, 11(6): 524-537

[14] Oka T, Miyahara M, Yamamoto J, et al. Application of metamorphosis assay to a native Japanese amphibian species, Rana rugosa, for assessing effects of thyroid system affecting chemicals [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2009, 72(5): 1400-1405

[15] 國家環境保護部. 環境保護部令第7號 新化學物質環境管理辦法[EB/OL]. (2010-01-19) [2014-05-27]. http://www.mep.gov.cn/gkml/hbb/bl/201002/t20100201_185231.htm

[16] 劉楚吾, 何曉曉, 肖亞梅. 過量的維生素 A 對黑斑蛙早期胚胎發育的影響[J]. 湖南師范大學自然科學學報, 1996, 19(4): 77-83

Liu C W, He X X, Xiao Y M. Effects of vitamin A excess on early embryonic development ofRananigromaculata[J]. Journal of Natural Science of Hunan Normal University, 1996, 19(4): 77-83 (in Chinese)

[17] Li X, Zhou J, Yu M, et al. Toxic effects of 1-methyl-3-octylimidazolium bromide on the early embryonic development of the frogRananigromaculata[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2009, 72(2): 552-556

[18] 王坤英, 李衛國, 趙艷紅, 等. 重金屬鉻對黑斑蛙胚胎和蝌蚪生長發育的影響及血細胞 DNA 損傷效應[J]. 河南師范大學學報: 自然科學版, 2007, 35(4): 199-202

Wang K Y, Li W G, Zhao Y H, et al. Effect of potassium dichromate on the development of embryo and tadpole of frog,Rananigromaculata, and on DNA Damage [J]. Journal of Henan Normal University (Natural Science), 2007, 35(4): 199-202 (in Chinese)

[19] 趙爾宓. 介紹一種蛙類胚胎及蝌蚪發育的分期[J]. 生物學通報, 1990(1): 13-15

[20] 張彤, 金洪鈞. 魚類和兩棲類胚胎幼體慢性毒性短期試驗[J]. 應用與環境生物學報, 1996, 2(3): 294-298

Zhang T, Jin H J. Short-term chronic toxicity test for embryo-larval fish and amphibians [J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 1996, 2(3): 294-298 (in Chinese)

[21] Osano O, Admiraal W, Otieno D. Developmental disorders in embryos of the frogXenopuslaevisinduced by chloroacetanilide herbicides and their degradation products [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2002, 21(2): 375-379

[22] Collins M D, Mao G E. Teratology of retinoids [J]. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 1999, 39(1): 399-430

[23] 曹慶珍, 錢麗娟, 張小利, 等. 視黃酸對熱帶爪蟾胚胎致畸效應的表型特征[J]. 華東師范大學學報(自然科學版), 2011, (2): 134-141

Cao Q Z, Qian L J, Zhang X L, et al. Teratogenic phenotypes induced inXenopustropicalisembryos by all-trans retinoic acid [J]. Journal of East China Normal University: Natural Science, 2011, (2): 134-141 (in Chinese)

[24] Schwetz B A, Keeler P A, Gehring P J. The effect of purified and commercial grade pentachlorophenol on rat embryonal and fetal development [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 1974, 28(1): 151-161

[25] Fort D J, Stover E L. Effect of low-level copper and pentachlorophenol exposure on various early life stages ofXenopuslaevis[J]. ASTM Special Technical Publication, 1996, 1306: 188-203

[26] 熊力, 馬永鵬, 毛思予, 等. 五氯酚對稀有鮈鯽胚胎毒性效應研究[J]. 中國環境科學, 2012, 32(2): 337-344

Xiong L, Ma Y P, Mao S Y, et al. Toxic effect of pentachlorophenol on the Chinese rare minnow embryos [J]. China Environmental Science, 2012, 32(2): 337-344 (in Chinese)

[27] Domingo J L. Metal‐induced developmental toxicity in mammals: A review [J]. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A Current Issues, 1994, 42(2): 123-141

[28] Jezierska B,ugowska K, Witeska M. The effects of heavy metals on embryonic development of fish (a review) [J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2009, 35(4): 625-640

[29] Iijima S, Spindle A, Pedersen R A. Developmental and cytogenetic effects of potassium dichromate on mouse embryos in vitro [J]. Teratology, 1983, 27(1): 109-115

[30] Thompson J, Bannigan J. Cadmium: toxic effects on the reproductive system and the embryo [J]. Reproductive Toxicology, 2008, 25(3): 304-315

[31] Rayburn J R, Fort D J, Mcnew R, et al. Synergism and antagonism induced by three carrier solvents with t-retinoic acid and 6-aminonicotinamide using FETAX [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 1991, 46(4): 625-632

[32] Sunderman F W, Plowman M C, Hopfer S M. Embryotoxicity and teratogenicity of cadmium chloride inXenopuslaevis, assayed by the FETAX procedure [J]. Annals of Clinical & Laboratory Science, 1991, 21(6): 381-391

[33] Bantle J A, Rayburn J R, Burton D T, et al. Initial interlaboratory validation study of FETAX: Phase I testing [J]. Journal of Applied Toxicology, 1994, 14(3): 213-223