毒死蜱對六種淡水節肢動物的毒性與風險評價

徐吉洋，張文萍，李少南 ，侯式娟

浙江大學農藥與環境毒理研究所 杭州 310029

毒死蜱是一種含氮雜環類有機磷類殺蟲殺螨劑，對害蟲具有觸殺、胃毒和熏蒸作用。可用于防治稻飛虱、稻縱卷葉螟等百余種大田作物害蟲，以及家畜寄生蟲等[1]。作為對于高等動物毒性相對較低的有機磷殺蟲劑，毒死蜱有著廣泛的應用前景。近年來，毒死蜱全球銷量在有機磷殺蟲劑中始終排名第一，在所有殺蟲劑中穩居前三位。該農藥在我國的年產量現已超過4萬噸[2]。隨著使用量的增加，毒死蜱親體及代謝產物有可能通過多種途徑進入地表水。Hall等[3]報道了美國the San Joaquin River Watershed1991-2001近十年間地表水中毒死蜱的檢測數據，其濃度為0.09～337×10-3mg·L-1。在澳大利亞南澳州的Mt. Lofty Ranges，Danielle 等[4]測得蘋果園和櫻桃園附近地表水中毒死蜱殘留濃度在0.02～0.11×10-3mg·L-1的范圍內變化。在西班牙地中海沿岸瀉湖Mar Menor的入水口，Campillo等[5]測得毒死蜱濃度變化范圍介于18.9～23.0×10-3mg·L-1之間，平均濃度為1.83×10-3mg·L-1。在該湖的水體中，Moreno-Gonzalez等[6]測得毒死蜱濃度變化范圍介于0.8～8.9×10-3mg·L-1。在泰國的Mea Sa流域，Sangchan等[7]在5月和8月測得上游水樣中毒死蜱濃度變化范圍介于0.08～0.65×10-3mg·L-1之間，下游水樣中毒死蜱濃度變化范圍介于0.04～0.2 ×10-3mg·L-1之間。在我國，吳長興等[8]按照推薦劑量施藥之后，測得毒死蜱在稻田“出水”中的殘留水平最高達到2.61×10-2mg·L-1；從河流引入的灌溉水中，毒死蜱殘留最高達到3.23×10-3mg·L-1。可見毒死蜱在水體中的廣泛存在是個不爭的事實。至于該農藥對于水生動物的毒性，以往對魚類有較多研究[9-11]。節肢動物當中，除了大型溞[12-13]，對于其他物種的研究還不夠充分。本文參照經濟合作與發展組織(OECD)“化學品測試準則”所提供的方法，以大型溞、老年低額溞、多刺裸腹溞、鋸緣真劍蚤、介形蟲、花翅搖蚊幼蟲作為受試生物，開展48 h急性毒性試驗，以探明毒死蜱對于水生節肢動物的急性毒性，為該農藥在水生生態系統的風險評估提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 受試生物

以大型溞Daphniamagna、多刺裸腹溞Moinamacrocopa、老年低額溞Simocephalusvetulus、鋸緣真劍蚤Eucyclopsserrulatus、介形蟲Pseudocandonasp.、花翅搖蚊ChironomuskiiensisTokunaga (1936) 東洋區廣布種作為受試生物。大型溞來源于中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所(原中國預防醫學科學院環境衛生和衛生工程研究所)，屬于62 DM生物株。其余物種均采自浙江大學華家池校區人工湖。采回的生物經過物種分離純化之后，在實驗室內培養至少3代(其中裸腹溞和低額溞采用孤雌生殖的后代)。3種溞在pH 7.8～8.9、電導率590～600 μs·cm-1的M4培養液[14]中進行培養，劍水蚤、介形蟲和花翅搖蚊培養在pH 7.3～7.4、電導率240～250 μs·cm-1的曝氣自來水中。

1.2 受試農藥與儀器

以純度為97%的毒死蜱(chlorpyrifos)原藥(浙江新農化工股份有限公司產品)作為受試藥劑。島津GC 2010(日本)，帶ECD檢測器，用于農藥殘留分析。

1.3 急性毒性試驗方法

大型溞等5種甲殼綱浮游動物的試驗方法參照OECD“化學品測試準則202”[15]。屬于昆蟲綱的花翅搖蚊幼蟲的試驗方法參照OECD“化學品測試準則235”[16]。溞類試驗以上述M4培養液作為稀釋水，劍水蚤、介形蟲和花翅搖蚊幼蟲試驗采用上述曝氣自來水作為稀釋水。先用丙酮將原藥配成母液，再用稀釋水配成不同濃度的稀釋液。各濃度組稀釋液中丙酮的終濃度不超過0.1 mL·L-1。設空白和溶劑(丙酮)兩組對照。溶劑對照中丙酮的終濃度與最高濃度組相同。溞類采用出生24 h幼體，花翅搖蚊采用2齡幼蟲，劍水蚤和介形蟲采用帶卵成蟲作為受試生物。試驗歷時48 h。試驗期間的水溫控制在22～24 ℃,每日光照時間控制在16 h，實驗設置重復4次，每個重復5頭供試生物。

我國環保部頒布的“化學農藥環境安全評價試驗準則”[17]將化學農藥對溞類的毒性劃分為3個等級： LC50≤1 mg·L-1為高毒，1 mg·L-110 mg·L-1為低毒。我國農業部采用的“化學農藥環境安全評價試驗準則”將化學農藥對溞類的毒性劃分為4個等級： LC50≤0.1 mg·L-1為劇毒，0.1 mg·L-110 mg·L-1為低毒。

1.4 稀釋液中毒死蜱含量測定

1.4.1 取樣及樣品前處理

從每一濃度組取150 mL稀釋液，輕輕震蕩使之均勻混合。用量筒準確量取100 mL，轉入500 mL分液漏斗中，加5% NaCl 50 mL，再加100 μL甲酸(≥88.0 %)，分別用50 mL二氯甲烷萃取3次，下層有機相過無水硫酸鈉，收集于250 mL平底燒瓶中，再用10～15 mL二氯甲烷淋洗無水硫酸鈉，淋洗液一并匯入平底燒瓶。將上述萃取液在40 ℃水浴上減壓濃縮至干，用2 mL乙酸乙酯溶解殘留物，過0.22 μm有機膜，待測。

1.4.2 檢測條件

進樣口溫度：240 ℃；檢測器溫度：250 ℃；載氣：高純N2(99.999%)；進樣模式：不分流；進樣量：1 μL；色譜柱：HP-5毛細管柱(0.32 mmID×30 m，0.25 μm df)；升溫程序：150 ℃保持2 min，15 ℃·min-1升至190 ℃，保持1 min，5 ℃·min-1升至240 ℃。毒死蜱在上述條件下的保留時間大約為7.7 min(圖1)，最小檢測濃度為0.1 μg·L-1。

1.4.3 標準曲線

用乙酸乙酯作為溶劑，配成濃度為100 mg·L-1的毒死蜱標準液(母液)，再依次稀釋到0.5 mg·L-1、0.1 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.01 mg·L-1、0.005 mg·L-1、0.001 mg·L-1。按照“1.3.2”所提供的條件進行測定，測得毒死蜱標準曲線方程為Y= 1 923 606.9X+29 610.068，R2=0. 9984。

1.4.4 添加回收率

按照“1.4.2”所提供的條件進行測定，毒死蜱在曝氣自來水中和M4培養液中的添加回收率測定結果見表1。圖1顯示毒死蜱在以M4配制的稀釋液中的色譜峰。

1.5 數據處理

1.5.1 “劑量-反應”關系

以用藥劑量的對數值為自變量(x)，以受試生物在相應劑量下的死亡百分率的幾率值為因變量(y)，應用DPS·數據處理軟件，求得“劑量_反應”關系，相關系數R、p值、LC50及其95%置信限。

1.5.2 毒死蜱實測濃度平均值

假定毒死蜱在試驗過程中的濃度下降符合對數曲線，采用“時間加權平均法”計算毒死蜱在整個試驗過程中的實測濃度平均值。可以用下列公式計算對數降解曲線下的“面積”：

面積=Co-Ct/LnCo-tLnCt

其中“C0”和“Ct”分別為受試物在“0”時間和“t”時間實測濃度(單位：mg·L-1)，“t”為時間間隔(單位：h)。將“面積”除以時間間隔“t”(單位：h)，即得到受試物在整個試驗周期內的“時間加權平均濃度”(單位：mg·L-1)。

表1 毒死蜱在曝氣自來水和M4培養液中的添加回收率Table 1 Recoveries of chlorpyrifos in aerated tap water and M4 culture medium

圖1 毒死蜱在稀釋液中的氣相色譜峰(濃度：16 μg·L-1)Fig. 1 GC peaks of chlorpyrifos in dilution (Conc.: 16 μg·L-1)

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 毒性試驗結果與討論

毒死蜱處理之后，受試溞類表現為沉底，游動少，不靈活；介形蟲表現為游動活潑；花翅搖蚊表現為軀體皺縮，只有頭部有輕微扣動。

根據毒性實驗數據得到的線性方程、R值、48 h-LC50、95%置信限及毒性評價。本文在測定毒性的同時，對于稀釋液中的農藥含量進行了測定。從表2中可以看出，按照實測濃度計算出的LC50，與按理論濃度計算出的相應值的差別在-14.7%～33.9%之間。無論以理論濃度，還是以實測濃度計，毒死蜱對上述六種水生節肢動物均屬于劇毒。毒死蜱對六種水生節肢動物的急性毒性大小順序均為：低額溞>裸腹溞>大型溞>介形蟲>劍水蚤>花翅搖蚊幼蟲。

毒死蜱雖屬于傳統有機磷殺蟲劑，其對于水生節肢動物的毒性，公開報道的研究資料仍然有限。毒死蜱對裸腹溞、劍水蚤和介形蟲的毒性測定結果迄今未見公開報道。吳長興等[8]和徐燕等[18]分別測得毒死蜱原藥對大型溞Daphniamagna幼體的48 h-LC50為1.44和3.30×10-3mg·L-1。Van Wijngaarden等[13]測得毒死蜱原藥對低額溞Simocephalusvetulus成體的48 h-LC50為0.40×10-3mg·L-1。Ali[19]測得毒死蜱原藥對搖蚊Chironomuscrassicaudatus4齡幼蟲的24 h-LC50是0.052 mg·L-1。與前人相比，本文的毒死蜱測定結果，對大型溞和低額溞偏毒性高，對花翅搖蚊幼蟲毒性偏低。

表2 急性毒性試驗結果匯總Table 2 Summary of the acute toxicity tests

2.2 暴露評估和風險表征

目前國內外大多采用商值法對于化學品的生態風險進行評估。所謂商值Q (quotient)，是指化學品在環境介質中的沉積量與其有害劑量(例如依據“劑量—反應”關系而得出的LC50、EC50，或通過差異顯著性分析而得出的NOEC/LOEC等)之間的比值。商值越高，化學品的風險越大[20-21]。商值屬于無單位量綱，故作為其決定因素之一的LC50、EC50等，應該盡可能以實測濃度(而非以名義濃度)進行推斷。把商值集合預先劃分為若干個數值區間，區間的臨界點代表著不同的關注水平(levels of concern, LOC)。將求得的商值與LOC相比較，即可以對相關化學品的風險性做出判斷。

目前人們普遍采用適當的數學模型來估算化學品的環境沉積量EEC (estimated environmental concentration)。GENEEC 2.0是美國EPA發布的一款暴露分析軟件。其“場景”中包含一塊面積為10公頃的“施藥區”和一方面積為1公頃、深度為2 m的池塘。后者為“污染關注區”。現以防治稻飛虱的720 g ai·ha-1作為推薦劑量，在“一次性噴霧”、“不設安全帶”、“施藥2 d后放水”等操作條件下，推算出毒死蜱在池塘中的初始EEC為5.38 μg·L-1(表3)。美國EPA將包括農藥在內的化學品的急性風險商值RQ(risk quotient)劃分為4個區間：RQ<0.05，無風險；0.05≤RQ<0.1，可能對瀕危物種有不利影響；0.1≤RQ<0.5，產生急性風險的可能性較高；RQ≥0.5，急性高風險[21]。將經由GENEEC 2.0模擬的EEC和以實測濃度推算的48 h-LC50帶入RQ計算公式，求得毒死蜱相對于大型溞、低額溞、裸腹溞、劍水蚤、介形蟲、花翅搖蚊幼蟲的急性RQ。它們分別為10.29、52.95、27.20、0.73、1.96、0.06。可見除了花翅搖蚊，在稻田中按照推薦劑量施用的毒死蜱對于棲息于田邊池塘中的水生節肢動物均具有較高的急性風險[17]。

以上結果說明：毒死蜱對于劍水蚤等5種甲殼綱浮游動物均具有較高程度的急性風險，需要進一步加強管理。

表3 以GENEEC預測農田附近池塘水中毒死蜱濃度Table 3 Estimation of concentration of chlorpyrifos in pond water adjacent to field under the help of GENEEC

注:a均來自農業部“農藥電子查詢服務系統"；b均來自英國"University of Hertfordshire"的"Pesticide Properties DataBase"； ai為有效成分，ha為公頃。

Note: a: are from the Ministry of Agriculture "Pesticide electronic inquiry service system"; b: are from the UK "University of Hertfordshire" and "Pesticide Properties DataBase"; ai is the active ingredient, ha is hectare.

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