原花青素對慢性應激模型大鼠抑郁焦慮樣行為的改善作用

土文珍，吳 凡，嚴奇植，楊學志，3，林 中，4，徐 震，石華孟，2，潘建春

（1．溫州醫科大學藥學院腦科學研究所，浙江溫州 325035；2．鹿城區人民醫院，浙江溫州 325007；3．溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江溫州 325000；4．溫州市人民醫院，浙江溫州 325000；5．溫州市第七人民醫院浙江溫州325005）

原花青素對慢性應激模型大鼠抑郁焦慮樣行為的改善作用

土文珍1，5，吳 凡1，嚴奇植1，楊學志1，3，林 中1，4，徐 震1，石華孟1，2，潘建春1

（1．溫州醫科大學藥學院腦科學研究所，浙江溫州 325035；2．鹿城區人民醫院，浙江溫州 325007；3．溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江溫州 325000；4．溫州市人民醫院，浙江溫州 325000；5．溫州市第七人民醫院浙江溫州325005）

目的研究原花青素（OPC）對慢性應激模型大鼠抑郁焦慮樣行為的影響及可能的作用機制。方法采用8種不同的應激因素，每天1種。應激前1 h ig給予OPC 25，50和100 mg·kg－1，連續21 d。從第22天起，給予藥物處理1 h后，每天檢測一個行為學指標。采用強迫游泳實驗測定不動時間；測定糖水偏嗜和大理石掩埋顆數；行為學測試結束后處死大鼠取組織，采用Western蛋白質印跡法測定海馬和前額葉內腦源性神經營養因子（BDNF）和磷酸化cAMP反應元件結合蛋白（p-CREB）的表達。結果慢性應激組大鼠表現出明顯的抑郁焦慮樣行為，而給予OPC 25，50和100 mg·kg－1后在強迫游泳測試中的不動時間則分別由慢性應激組的（90．57±4．27）s下降為（78．25±2．53）s（P＜0．05），（72．12±3．21）s（P＜0．05）和（60．77±3．41）s（P＜0．05）。OPC 50和100 m g·kg－1組糖水消耗率則由慢性應激組的（42．80±4．92）%增加為（67．54±4．32）%（P＜0．05）和（72．21±7．99）%（P＜0．05），OPC 50和100 mg·kg－1組的大理石掩埋顆數由慢性應激組的1．57±0．21下降為0．63±0．26（P＜0．05）和0．44± 0．18（P＜0．05）。OPC 25，50和100 mg·kg－1組海馬內p-CREB的表達均有顯著性增加（P＜0．05），前額葉內p-CREB的表達亦顯著性增加（P＜0．05），OPC 50和100 m g·kg－1組海馬及前額葉中BDNF的表達也均有增加（P＜0．05）。結論OPC可以改善由于慢性應激對大鼠造成的抑郁和焦慮樣行為，其機制可能與其能夠增強cAMP-CREB-BDNF信號轉導通路有關。

原花青素；慢性應激；抑郁；焦慮；腦源性神經營養因子；cAMP反應元件結合蛋白

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．03．006

原花青素（proanthocyanidins，OPC）是一種由兒茶素、表兒茶素形成的多酚類化合物，它廣泛存在于植物的種子、果實和樹皮中，也存在于某些飲料（茶葉、啤酒）和蔬菜中，葡萄籽中含量最高可達95%。大量的實驗和臨床研究表明，OPC具有抗氧化、鎮痛和心臟保護作用，并且安全。體內外實驗研究表明，葡萄籽提取物OPC在對單胺氧化酶的活性影響顯著［1－3］，陳桂香等［4］發現OPC能顯著縮短應激大鼠游泳不動時間，減輕應激大鼠對環境的絕望心理，說明OPC可能存在抗抑郁活性。

慢性應激模型可模擬環境誘因，是迄今應用最廣泛的抑郁動物模型之一。研究表明，慢性應激抑郁大鼠海馬和額葉內cAMP含量、cAMP依賴蛋白激酶A（p rotein kinase A，PKA）表達以及cAMP反應元件結合蛋白（cyc lic AMP response e lem entbinding protein，CREB）表達都會發生相應變化［5］。應激模型小鼠海馬內腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）表達下降。海馬和額葉是情緒情感腦區，BDNF低水平表達間接導致了抑郁癥的發生［6－8］。慢性應激或長期處于應激水平糖皮質激素作用下，海馬神經元會發生萎縮甚至死亡［9］，而CREB通路的激活可以介導BDNF的表達從而促進神經元的再生，說明抑郁的發病機制可能涉及cAMP-PKA-CREB-BDNF信號通路。

本研究通過建立慢性的大鼠應激模型，并且結合其行為學上的變化以及腦內相關蛋白表達的差異，試圖從cAMP-PKA-CREB-BDNF信號轉導通路研究OPC抗抑郁作用及機制。

1 材料與方法

1．1 藥物、試劑及儀器

葡萄籽提取物，OPC含量≥95%，購于天津尖峰天然產物研究開發有限公司，氟西汀（fluoxetine，FLU）購于美國Sigma公司；兔抗大鼠CREB（貨號：AB3006）和p-CREB（貨號：06-519）一抗購于美國M illipore公司；兔抗大鼠BDNF（貨號：AB6201）和β肌動蛋白（貨號：ab1801）一抗購于美國Abcam生物公司。辣根過氧化物酶酶標記驢抗兔lgG二抗（貨號：sc-2313）購于美國Santa公司。脫脂奶粉（批號：3106120）購于碧迪醫療器械（上海）有限公司；PVDF膜（貨號：IPVH00011）和30%聚丙烯酰胺購于（批號：20130423）Solarbio公司，Tris-Hcl（批號：B0012K02130001，純度＞99%）購于中國Biosharp公司，SDS（貨號：ST627）、APS（貨號：ST005）、TEMED（貨號：ST728）及BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0012）均購于上海碧云天生物技術有限公司；ECL曝光液（批號：120711-92）購于美國Abcam生物公司。

DigBehv動物行為分析系統（上海吉量軟件科技有限公司）；BS110S分析天平（北京賽多利斯儀器公司）；3-18型低溫高速離心機（美國Beckman公司）；超聲勻漿器（軍事醫學科學院實驗儀器廠）；pH S-25型酸度計（上海醫用核子儀器廠）；550型全自動酶標儀、電泳儀和Gel Doc XR凝膠成像儀均購于美國Bio-Rad公司。

1．2 動物及慢性不可預知應激模型的建立

SD系雄性大鼠，二級，48只，體質量200～220 g，由中國科學院上海動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2010-0150。每籠8只，室溫（24± 1）℃，濕度（50±10）%，自然光照，晝夜節律，自由攝食飲水。

動物適應4 d后開始實驗。按文獻［10］制作大鼠應激模型，應激時程共計21 d，每日1次，每天選取8種刺激中的1種進行刺激：夾尾（距尾根1 cm）1 m in；禁水（水瓶取掉12 h后，放空瓶1 h，之后恢復正常飲水）；禁食（鼠糧取空12 h后，每籠放3 g鼠糧2 h，之后恢復正常飲食）；潮濕墊料4 h；換籠孤養24 h；晝夜顛倒12 h；4℃冰水游5 m in；30℃熱水游泳5 m in；游泳刺激時間和形式每天隨機，3 d內不重復。

1．3 分組處理

大鼠隨機分為6組：正常對照組、應激模型組、OPC 25，50和100 mg·kg－1ig給藥組、FLU 10 mg·kg－1（ip給藥）組。按照1．2項制備模型的同時，每天給予刺激1h前按照分組給藥，正常對照組和模型組ig給予等體積的0．5%羧甲基纖維素鈉溶液。連續21 d。第22天開始進行行為測試，每天進行一種實驗，測試前1 h同樣按照分組給藥，行為學結束后用10%水合氯醛麻醉，處死大鼠，取腦組織。

1．4 強迫游泳實驗測定不動時間

按照文獻［11］所描述的方法進行強迫游泳實驗。測試前1 d，將大鼠放于盛有清水的玻璃容器中（45 cm×35 cm×60 cm）水深30 cm，水溫（24±0．5）℃訓練15 m in，24 h后進行游泳測試，記錄5 m in游泳測試中的不動時間。當大鼠停止掙扎，浮在水中保持不動，或僅做一些必要的輕微動作保持頭部浮在水面上的時間視為不動時間。不動時間由對實驗不知情者記錄。

1．5 糖水消耗［12］

大鼠首先試飲1%的蔗糖水48 h，試飲后正常進食1 d。訓練流程結束后開始正式測試實驗，每只大鼠單籠飼養，禁食禁水24 h后同時給予1%的蔗糖水和自來水各1瓶，記錄1 h內1%的蔗糖水和自來水各自的消耗量，用糖水消耗率來表示實驗結果。糖水消耗率（%）＝糖水消耗量／（糖水消耗量＋自來水消耗量）×100%。

1．6 大理石掩埋測試

按照文獻［13］稍作修改，大鼠單獨放入47 cm×27 cm×15 cm（長×寬×高）的盒子中，盒中放5 cm深的玉米芯墊料，在籠子內放9顆直徑2．3 cm的大理石珠子，放2排，每排4顆，2排之間放一個大理石珠子。將大鼠放入籠中，在紅色燈光和白色噪聲下測試10 m in，統計埋起來的珠子顆數。珠子埋入墊料一半及以上則記入埋珠數。

1．7 W es tern蛋白質印跡法檢測p-CREB和BDNF表達

各組樣本加300μL的細胞裂解液（含蛋白酶和磷酸化酶抑制劑），勻漿后4℃下14 000×g離心10 m in，2次后取上清液，BCA法進行蛋白定量。各組蛋白取60μg樣品，15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕法轉膜法將蛋白轉移到PVDF膜上，室溫下0．5%脫脂牛奶封閉1．5 h，用0．05% TBST稀釋的一抗（1∶1000稀釋）（β肌動蛋白，p-CREB，CREB及BDNF）4℃孵育過夜，洗膜3次，每次7 m in，洗完后加入辣根過氧化物酶偶聯的IgG二抗（1∶10 000稀釋）反應1 h，洗膜3次，每次7 m in。ECL法顯色，β肌動蛋白作為內參照，以目標蛋白與內標蛋白的積分吸光度的比值表示蛋白的相對表達量。

1．8 統計學分析

2 結果

2．1 原花青素對慢性應激大鼠游泳不動時間和糖水消耗比的影響

Fig．1 Effect o f p roanthocyanidins（OPC）on immobility time o f stressed rats by fo rce sw imm ing test．One method was selected from 8 different stress methods each day，and the rats were treated w ith OPC（25，50 and 100 mg·kg－1）1 h before the stressmethod．The chronically stressed modelwas established after 21 d stress experiment．，n＝8．**P＜0．01，compared with normal control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，compared with stressed modelgroup．

Fig．2 Effec t o f OPC on suc rose preference o f stressed rats by sucrose consum p tion test．See Fig．1 for the treatment．，n＝8．**P＜0．01，compared with normal control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，compared with stressed modelgroup．

圖1及圖2結果顯示，與正常組相比，應激組大鼠在強迫游泳實驗中的不動時間明顯增加，糖水偏愛性明顯降低（P＜0．01）。與應激組相比，OPC 3個劑量組均可以顯著減少不動時間（P＜0．05， P＜0．01），其中OPC 100 mg·kg－1組的作用效果與FLU組相似。與應激組相比，OPC 25 mg·kg－1組能夠增加大鼠對糖水的偏愛性但不夠明顯（P＞0．05），而OPC 50和100 mg·kg－1組改善作用明顯（P＜0．05），且OPC 100 mg·kg－1組作用效果與FLU 10 mg·kg－1組相當。

2．2 原花青素對慢性應激大鼠掩埋大理石顆數的影響

圖3結果顯示，與正常組相比，應激組大鼠掩埋大理石顆數明顯增加（P＜0．01）。與應激組相比，OPC 25，50和100 mg·kg－1組掩埋顆數均出現不同程度的減少，OPC 25 mg·kg－1組掩埋顆數減少不明顯（P＞0．05），而OPC 50 m g·kg－1組掩埋顆數減少明顯（P＜0．05），OPC 100 mg·kg－1組對大理石掩埋實驗的改善作用作用和FLU 10 mg·kg－1組接近。

Fig．3 Effec t o f OPC on num be r o f bu ried m arb les o f stressed rats．See Fig．1 for the treatment．，n＝8．**P＜0．01，compared w ith normal control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，compared with stressed m odel group．

2．3 原花青素對慢性應激大鼠海馬及前額葉p-CREB水平的影響

如圖4所示，應激組海馬和前額葉中的p-CREB表達較正常組均出現了顯著地降低（P＜0．01），而在給予OPC后大鼠海馬和前額葉中的p-CREB表達均顯著增加（P＜0．05），OPC 100 mg·kg－1組的作用效果與FLU 10 mg·kg－1組相似。

2．4 原花青素對慢性應激大鼠海馬及前額葉BDNF表達的影響

如圖5所示，應激組海馬和前額葉中BDNF表達較正常組均出現了顯著地降低（P＜0．01），而在給予OPC后大鼠海馬和前額葉中的BDNF表達都呈現出了不同程度的增加，但OPC 25 mg·kg－1組無顯著性差異，OPC 50 mg·kg－1組作用明顯（P＜0．05），OPC 100 mg·kg－1組的作用效果與FLU 10 mg·kg－1組相似。

Fig．4 Effec t o f OPC on p-CREB exp ression in the hippocam pus（A）and fron tal co rtex（B）o f stressed rats by Western b lotting．See Fig．1 for the treatment．Lane 1：normal control；lane 2：stress model group；lanes 3－5：stress＋OPC 25，50 and 100 mg·kg－1group，respectively；lane 6：stress＋FLU 10 mg·kg－1group．A2 and B2 were the sem i quantitative results of A1 and B1，respectively．，n＝8．**P＜0．01，compared w ith normal control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，compared w ith stressed modelgroup．

Fig．5 Effec t o f OPC on b rain derived neu ro trophic facto r（BDNF）exp ression in the hippocam pus（A）and fron tal co rtex（B）o f stressed rats by Western b lotting．See Fig．1 for the treatment．A2 and B2 were the sem i quantitative result of A1 and B1，respectively．，n＝8．**P＜0．01，compared with norm al control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，compared with stressed m odel group．

3 討論

本研究結果顯示，大鼠經過21 d的慢性不可預知應激后，強迫游泳測試中不動時間的增加；糖水偏愛性減少，表現出運動能力下降，絕望感增強，興趣缺乏，快感缺失等，與抑郁癥患者表現具有相似性。大理石掩埋測試中，掩埋顆數增加，與部分抑郁癥患者伴有焦慮情緒相似。給予OPC后，可明顯改善慢性應激大鼠的抑郁焦慮樣行為。

BDNF可促進神經元的生長發育，以及維持成年后神經元的生存和功能［14］，其對神經元可塑性也有一定的影響［15］。慢性應激導致大鼠海馬區BDNF表達明顯降低，表現為持續功能性的BDNF調節缺陷［16］。海馬和前額葉主要影響動物的情感、動機、學習和記憶行為，這些行為的變化與抑郁焦慮關系密切［17］。自殺者尸檢結果顯示，抑郁癥患者海馬BDNF m RNA較正常人減少［18］；與生前未進行抗抑郁劑治療的抑郁患者相比，生前服用抗抑郁劑者海馬BDNF表達水平升高［19］。有文獻報道，抑郁癥患者血清BDNF也顯著低于正常水平［20］。本研究結果顯示，應激大鼠海馬、前額葉皮質的BDNF蛋白表達水平降低，給予OPC后能夠逆轉這個趨勢，與文獻報道一致。這說明OPC抗抑郁機制可能涉及BDNF上調，影響海馬及前額葉皮質神經元再生及突觸可塑性，保護慢性應激引起的海馬和前額葉皮質神經元損傷。本實驗室前期研究表明，慢性應激大鼠額葉皮質、海馬等腦區腺苷酸環化酶（AC）活性下降，cAMP水平降低，提示慢性應激可能使AC-cAMP信號轉導通路受損［21］，從而降低BDNF的表達。CREB只有在其Ser133位點磷酸化，才能與cAMP結合發揮轉錄激活作用。本研究發現，海馬和前額葉皮質神經元中，慢性應激對CREB的總量變化影響不明顯，但是顯著減少p-CREB的表達量。給予OPC后可以拮抗應激條件下p-CREB的減少，這與臨床上發現抑郁患者顳葉皮質磷酸化CREB m RNA（pCREB mRNA）表達減少，而抗抑郁治療能逆轉這種減少相一致［22］，說明OPC可能拮抗cAMP-CREB通路損傷，增加CREB的磷酸化，增加BDNF的表達來發揮抗抑郁焦慮樣作用。因此，推測OPC通過上調AC活性來增加cAMP水平，從而上調p-CREB的表達，促進BDNF的合成。BDNF進一步增加突觸的形成和成熟，促使神經元的發育、分化和存活，發揮抗抑郁焦慮樣作用。

綜上所述，OPC可以改善逆轉慢性應激引起的抑郁和焦慮樣行為，機制可能涉及上調cAMPCREB-BDNF信號轉導通路有關。今后本課題組將對OPC影響神經元再生、神經可塑性方面開展研究，進一步明確OPC抗抑郁焦慮樣行為機制。

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Pro tec tive effect o f p roan thocyanid ins on dep ression and anxiety behavio r in ch ronically stressed rats

TU Wen-zhen1，5，WU Fan1，YAN Qi-zhi1，YANG Xue-zhi1，3，LIN Zhong1，4，XU Zhen1，SHIHua-m eng1，2，PAN Jian-chun1
（1．Institute of Brain Science，W enzhou Medical University，Wenzhou 325035，China；2．Lucheng District Peop le′s Hospital，Wenzhou 325007，China；3．The First Affiliated Hospita l，Wenhzou Medical University，Wenzhou 325000，China；4．Wenzhou People′s Hospital，Wenzhou 325000，China；5．Wenzhou Seventh People′s Hospital，Wenzhou 325005，China）

OBJECTlVETo investigate the antidepressant and antianxiety effect of proanthocyanidins（OPC）in chronically stressed rats and its underlying mechanism．METHODSOne method was se lected from 8 different stress m ethods each day，and the rats were treated w ith OPC（25，50 and 100 mg·kg－1）1 h be fore the stress method．The chronica lly stressed modelwas established．After 21 d stress experim ent，the imm obility tim e in force sw imm ing test，sucrose consum ption and the num ber o f m arbles buried in the m arb le burying test were observed respectively each day．OPC（25，50 and 100 mg·kg－1）was given 1 h be fore each test．In addition，Western b lotting was used to ana lyze the expression of brain derived neurotrophic factor（BDNF）and phosphorylated cyclic AMP response element-binding protein（p-CREB）in the hippocampus and frontal cortex．RESULTSCompared with the control group，the chronically stressed group showed obvious depressive-like and anxiety-like behavior，while the immobility time decreased from（90．57±4．27）s in chronically stressed group to（78．25± 2．53）s（P＜0．05），（72．12±3．21）s（P＜0．05）and（60．77±3．41）s（P＜0．05）when ig given OPC 25，50 and 100 m g·kg－1respective ly，the ratio o f sucrose p re ference increased from（42．80±4．92）% to（67．54±4．32）%（P＜0．05）and（72．21±7．99）%（P＜0．05）when ig given OPC 50 and 100 m g· kg－1respective ly，the num ber o f buried m arb les decreased from 1．57±0．21 in chronically stressed group to 0．63±0．26（P＜0．05）and 0．44±0．18（P＜0．05）when ig given OPC 50 and 100 mg·kg－1respective ly．The exp ression of p-CREB in the hippocam pus and fronta l cortex distinctive ly increased in OPC group（25，50 and 100 mg·kg－1）（P＜0．05），so did the expression of BDNF in the hippocampus and frontal cortex in OPC group（50 and 100 mg·kg－1）（P＜0．05）．CONCLUSlONOPC can reverse the depressive-like and anxiety-like behavior in chronically stressed rats，which may be related to the cAMP-CREB-BDNF signal transduction cascades．

proanthocyanidins；chronic stress；depression；anxiety；brain derived neurotrophic factor；cyc lic AMP response e lem ent-binding p rotein

SHIHua-meng，E-mail：1056581618＠qq．com，Tel：（0577）55565235；PAN Jian-chun，E-mail：wenzhoupan2003＠163．com，Tel：13857750765

R285，R964

A

1000-3002（2014）03-0345-06

Foundation item：The project supported by Science and Technology Planning Foundation o f Wenzhou City（Y20120002）；and Science and Technology Planning Foundation of Lucheng Distric t ofWenzhou City（S11101）

2013-10-21 接受日期：2014-03-20）

（本文編輯：喬 虹）

溫州市科技計劃項目（Y20120002）；鹿城區科技計劃項目（S11101）

土文珍（1975－），女，主治醫師，主要從事精神病臨床與藥理學研究，E-mail：964369120＠qq．com，Tel：13858892331。

石華孟，E-mail：1056581618＠qq．com，Tel：（0577）55565235；潘建春，E-mail：wenzhoupan2003＠163．com，Tel：13857750765