替莫唑胺聯合粉防己堿對人腦膠質瘤U87細胞的抑制作用

張 勇，馬繼偉，李海瑩，王紹祥，3，閆雍容，劉子豪，杜 彬，鐘雪云

（暨南大學1．醫學院病理教研室，2．廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室，3．生物醫藥研究開發基地廣東省生物工程藥物重點實驗室，廣東廣州 510632）

ZHANG Yong1，2，MA Ji-wei1，2，LIU Hai-ying1，2，WANG Shao-Xiang1，2，3，YAN Yong-rong1，2，LIU Zi-hao1，2，DU Bin1，2，ZHONG Xue-yun1，2

（1．Departm ent o f Patho logy，Medica l Co llege，2．Guangdong Provincia l Key Laboratory o f Mo lecu lar Immunology and Antibody Engineering，3．Guangzhou Jinan Biomedicine Research and Development Center，Guangdong Provincial Key Laboratory of Bioengineering Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

替莫唑胺聯合粉防己堿對人腦膠質瘤U87細胞的抑制作用

張 勇1，2，馬繼偉1，2，李海瑩1，2，王紹祥1，2，3，閆雍容1，2，劉子豪1，2，杜 彬1，2，鐘雪云1，2

（暨南大學1．醫學院病理教研室，2．廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室，3．生物醫藥研究開發基地廣東省生物工程藥物重點實驗室，廣東廣州 510632）

目的探討粉防己堿與替莫唑胺聯合用藥對人腦膠質瘤細胞U87細胞存活、克隆形成、遷移能力及凋亡的影響。方法 采用CCK-8法檢測粉防己堿8～64μmol·L－1，或替莫唑胺50～400μmol·L－1，或替莫唑胺＋粉防己堿3．2和6．4μmol·L－1作用24 h后細胞存活率。粉防己堿6．4μmol·L－1、替莫唑胺100μm o l·L－1或替莫唑胺＋粉防己堿3．2和6．4μm o l·L－1作用24 h后，Giem sa染色檢測細胞的克隆形成；Transwell小室檢測細胞遷移能力；流式細胞術AnnexinⅤ／PI雙染法檢測細胞凋亡；W estern蛋白質印跡法檢測Bcl-XL、活化胱天蛋白酶3及活化聚ADP核糖聚合酶（PARP）蛋白表達。結果 CCK-8實驗結果顯示，單用粉防己堿和替莫唑胺均能抑制U87細胞的生長，且具有濃度依賴性（r＝0．903，P＜0．05），替莫唑胺100μm ol·L－1＋粉防己堿3．2和6．4μm o l·L－1抑制率高于兩藥單用，經分析兩者作用為相加。替莫唑胺可抑制U87細胞的克隆形成和遷移能力，兩藥聯用時比單用替莫唑胺抑制作用更明顯（P＜0．05）；與單用替莫唑胺相比，兩藥聯用時抗凋亡蛋白Bcl-XL明顯減少，執行凋亡的活化的剪切胱天蛋白酶3蛋白及剪切PARP明顯增多。結論 粉防己堿聯用替莫唑胺能明顯抑制人腦膠質瘤U87細胞的生長、克隆形成及遷移能力，并誘導激活胱天蛋白酶3依賴的細胞凋亡。

粉防己堿；替莫唑胺；U87細胞；細胞凋亡

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．03．010

腦膠質瘤是最常見的中樞神經系統疾病之一，其中腦膠質母細胞瘤的惡性程度最高，為WHOⅣ級，具有組織異型性和侵襲性，復發率很高，且生存率往往不到1年。因此，迫切需要發展新的治療方法和藥物，進一步改善腦膠質瘤的患者生存質量、延長生存率。粉防己堿（tetrandrine，TET）來源于防己科植物粉防己的根，研究表明，TET具有抗癌作用，包括乳腺癌、食管癌、鼻咽癌、結腸癌、肺癌、肝癌、成神經細胞瘤及腦膠質瘤［1］。TET聯合化療藥物紫杉醇對人胃癌細胞MKN-45的增殖抑制及凋亡誘導有良好的協同效應［2］。體內研究報道，TET可降低大鼠膠質瘤生長速率，延長荷瘤大鼠生存時間，對大鼠皮下和腦內膠質瘤均具有抗癌作用［3］。替莫唑胺（temozolom ide，TMZ）以其高脂溶性和易于通過血腦屏障的特性，是化療的首選藥物，其不良反應輕，廣泛用于臨床［4］。雖然TMZ的應用在一定程度上改善了腦膠質瘤患者的預后，但是其單獨用藥的有效率仍然有待提高，且單用時會導致腦膠質瘤耐藥的產生，限制了其臨床效果，因此，尋找TMZ的聯合用藥策略，對于增強腦膠質瘤化療效果、改善患者生存質量、減少膠質瘤復發都尤為重要。

TET是屬雙芐基異喹啉類化合物，具有抗炎、免疫抑制［5］及抗癌作用。研究表明，TET多通過促進細胞凋亡、抑制其增殖來實現抗癌作用，且大部分的促凋亡和抑制增殖的作用呈時間及濃度依賴性［6］，其促凋亡作用主要通過線粒體通路誘導細胞凋亡。但關于TET對人腦膠質瘤的臨床療效的文獻還比較局限，其具體的抗膠質瘤作用機制及與其他藥物或治療方法的聯用效果，都有待更深入的研究。本研究通過TMZ聯合應用TET，探討它們對人腦膠質瘤U87細胞增殖生長等生物學行為的影響，為臨床治療腦膠質瘤聯合用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 藥物、試劑及主要儀器

TET及TMZ購自美國Sigm a公司，人腦膠質瘤細胞系U87購自上海中科院細胞庫，細胞復蘇后置于DMEM完全培養基中，37℃，5%CO2，95%濕度培養箱中培養；二甲亞砜（DMSO）、胰蛋白酶（trypsin，1∶250）購自美國Sigma公司；AnnexinⅤ／PI雙染試劑盒購自北京寶賽生物技術公司；CCK-8（cell count kit-8）細胞計數試劑購自日本同仁化學研究所；Transwell小室購自美國Corning公司；β肌動蛋白（克隆號13E5），Bc l-XL（克隆號54H6），活化多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶〔poly（ADP-ribose）polymerase，PARP；克隆號Asp214，D64E10〕，活化胱天蛋白酶3（克隆號D175，5A1E）抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；化學發光試劑（ECL）購自美國Pierce公司；Olym pus倒置顯微鏡，日本；流式細胞儀，BDFACScantoTM，美國。

1．2 CCK-8法檢測細胞存活

取對數生長期的U87細胞，調成每孔5000個的細胞懸液接種于96孔板，每孔100μL，置于37℃，5%CO2，95%濕度培養箱中培養24 h后去上清，分別加入TET 8，16，32，48和64μm o l·L－1或TMZ 50，100，200，300和400μmol·L－1及濃度梯度的TMZ＋TET 3．2或6．4μmo l·L－1，同時設正常對照組，每組5復孔。各組用DMEM培養基培養24 h后，每孔加入10μL CCK-8試劑，繼續培養1 h，酶標儀檢測吸光度值（A）（測定波長450 nm，參比波長655 nm），計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）＝（1－A實驗組／A對照組）×100%。

1．3 克隆形成實驗

取對數生長期的U87細胞，調成每孔800個細胞懸液接種于6孔板，培養24 h后分別加入TMZ 100μm o l·L－1，TET 6．4μm o l·L－1，TMZ聯合TET 3．2和6．4μmol·L－1，終體積為每孔2 m L，正常組加入DMSO作為對照，培養7 d后，吸去培養液，PBS洗滌2次后，4%多聚甲醛固定液固定10 m in后晾干，吉姆薩染液染色15 m in后流水沖洗晾干，倒置顯微鏡下計數細胞克隆（＞20細胞為1個克隆）并拍照，IPP采集圖像分析。克隆形成抑制率（%）＝（1－實驗組細胞克隆數／對照組細胞克隆數）×100%。

1．4 Transw ell實驗檢測細胞遷移能力

在Transwe ll下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養基600μL，待檢細胞饑餓處理12 h以無血清DMEM培養基制成單細胞懸液，按1．3項分組處理的100μL細胞懸液種于上室，置于37℃，5%CO2，95%濕度培養箱中培養24 h后取出小室，棄去小室內培養液，濕棉簽擦去上面未穿過微孔的細胞，4%多聚甲醛固定1 h，風干后置于0．1%結晶紫中染色1 h，倒置顯微鏡下觀察。隨機取5個視野，計數每個視野內的穿過微孔的細胞數，以遷移細胞的相對數目來表示腫瘤細胞的侵襲能力，遷移抑制率（%）＝（1－實驗組侵襲細胞數／對照組侵襲細胞數）×100%。

1．5 AnnexinⅤ／Pl雙染法檢測細胞凋亡

取對數生長期細胞接種于6孔培養板過夜，棄上清，按1．3項分組處理的細胞每組設3復孔。培養48 h后，PBS洗滌細胞3次，按試劑盒說明書分別加入AnnexinⅤ-FITC和PI，4℃避光反應30 m in，再加入300μL結合緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1．6 Western蛋白質印跡法檢測Bc l-XL，活化多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶及活化胱天蛋白酶3表達

將1．3項處理后的細胞，用PBS沖洗，冰上充分裂解后，置于4℃，13 400×g離心30 m in，取上清液，測定蛋白含量，加入上樣緩沖液沸水中煮沸5 m in，進行SDS-PAGE電泳。300 m A恒流轉膜；膜封閉1 h，然后加一抗在4℃孵育過夜。次日加二抗于搖床室溫孵育1 h，然后經ECL發光試劑（Pierce）顯影，最后于暗室X線膠片感光。以目標蛋白與內標的積分吸光度的比值表示蛋白相對表達量。

1．7 統計學分析

2 結果

2．1 粉防己堿及其與替莫唑胺聯合應用對U87細胞存活的影響

如圖1所示，單用TET或TMZ對U87細胞存活有抑制作用，抑制率與藥物濃度呈正相關（r＝0．903，P＜0．05；r＝0．995，P＜0．05），TET和TMZ對人腦膠質瘤U87細胞的IC50分別為（20．91± 3．71）μmol·L－1和（292．15±8．36）μmol·L－1。采用抑制率＜30%的濃度進行藥物的聯合實驗，如圖1B，TMZ＋TET 3．2和6．4μm o l·L－1，其抑制率較單用 TMZ有下調趨勢，尤其當 TMZ＜200μmol·L－1效果更為明顯。當TMZ濃度為50和100μmo l·L－1時，兩者聯合用藥抑制細胞存活作用比單用TMZ更明顯。經計算分析表明，TMZ 100μmol·L－1＋TET 6．4μmol·L－1時，CI＝1．049，說明兩藥為疊加作用。

Fig．1 Effect o f tetrand rine（TET）alone or in combination w ith temozo lom ide（TMZ）on U87 cell grow th．The cell viability was performed with a CCK-8 assay when U87 cells were treated with TET，TMZ and TMZ combined w ith TET for24 h．，n＝5．*P＜0．05，compared with TMZ 0μmol·L－1group；＃P＜0．05，compared with TMZ group of the same concentration．

2．2 粉防己堿與替莫唑胺聯合應用對U87細胞克隆形成的影響

與正常對照組相比，單用TET 6．4μm o l·L－1或 TMZ 100μm o l·L－1處理細胞克隆有減少趨勢，抑制率分別為（30．2±2．4）%，（28．2±1．4）%；與單用TET及TMZ組相比，TMZ＋TET 3．2和6．4μmol·L－1組細胞克隆明顯減少（P＜0．05），其抑制率分別為（69．1±2．1）%和（76．5±2．0）%，表明TET合用TMZ能有效抑制U87細胞增殖。

2．3 粉防己堿與替莫唑胺聯合應用對U87細胞遷移能力的影響

Transwe ll小室遷移實驗結果（圖2）顯示，TMZ 100μm o l·L－1組、TET 6．4μm o l·L－1組、TMZ＋TET 3．2和6．4μmol·L－1組細胞遷移抑制率分別為（9．4±1．4）%，（12．9±1．0）%，（29．2± 1．6）%和（46．8±3．4）%，表明與單用TET組及TMZ組相比，TET合用TMZ能有效減弱U87細胞遷移能力（P＜0．05）。

Fig．2 Effec t o f TMZ com bined w ith TET on m ig ration ability o f U87 cells after 24 h treatm en t by transw e ll assay（×100）．A：normalcontrol；B：TMZ 100μm ol·L－1；C：TET 6．4μmol·L－1；D：TMZ 100μmol·L－1＋TET 3．2μmol·L－1；E：TMZ 100μmol·L－1＋TET 6．4μmol·L－1．Arrwos show the migrating cells．

2．4 粉防己堿與替莫唑胺聯合應用對U87細胞凋亡的影響

AnnexinⅤ／PI雙染流式細胞儀檢測結果顯示（圖3和表1），與單用TET及TMZ組相比，TMZ＋TET 3．2和6．4μmol·L－1組細胞早期凋亡率和晚期凋亡及壞死率均明顯增多（P＜0．05，P＜0．01），表明TET合用TMZ能促進U87細胞凋亡。

Fig．3 Effect o f TET combined w ith TMZ on U87 cell apop tosis detected by flow cytometry after 48 h treatm en t．A：norm al control；B：TMZ 100μmol·L－1；C：TET 6．4μmol·L－1group；D：TMZ＋TET 3．2μm ol·L－1group；E：TMZ＋TET 6．4μm ol·L－1group．

Tab．1 Effect o f TET combined w ith TMZ on U87 apop tosis

2．5 粉防己堿與替莫唑胺聯合應用對U87細胞凋亡相關蛋白的影響

Western蛋白質印跡法結果（圖4）顯示，TMZ組的抗凋亡蛋白Bcl-XL，活化胱天蛋白酶3及活化PARP變化不明顯；TET組的抗凋亡蛋白Bcl-XL表達減少，活化PARP表達增多；與單用TET組及TMZ組相比，TMZ＋TET 3．2和6．4μmol·L－1組，抗凋亡蛋白Bc l-XL明顯減少，執行凋亡的活化胱天蛋白酶3蛋白及活化PARP明顯增多（P＜0．05）。

Fig．4 E ffec t o f TET com bined w ith TMZ on p ro tein exp ression o f U87 ce lls detec ted by Western b lo tting after 48 h treatment．C-PARP：cleaved poly（ADP-ribose）polymerase．Lane 1：normal control；lane 2：TMZ 100μmol·L－1；lane 3：TET 6．4μmol·L－1；lane 4：TMZ 100＋TET 3．2μmol·L－1；lane 5：TMZ 100μmol·L－1＋TET 6．4μmol·L－1．B was the semi-quantitative resultof A．，n＝3．*P＜0．05，**P＜0．01，com pared with normal control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，com pared w ith TMZ group；△P＜0．05，△△P＜0．01，compared with TET group．

3 討論

本研究結果表明，TET聯合TMZ能抑制U87細胞增殖，減弱其細胞遷移能力，促進細胞凋亡。有報道發現，在人白血病細胞U937中，TET通過誘導細胞內活性氧的產生，從而激活JNK和胱天蛋白酶，促進細胞凋亡［8］；在人肝母細胞瘤HepG2細胞株中，TET上調p53，激活胱天蛋白酶3及胱天蛋白酶9，剪切PARP（cleaved-PARP，C-PARP），下調抑制凋亡的蛋白Bcl-XL和Bcl-2的表達，表明TET主要通過線粒體途徑誘導細胞凋亡發揮抗腫瘤作用［9］。

盡管如此，有研究表明，TET可下調耐藥蛋白P-糖蛋白介導的藥物外排來逆轉多藥耐藥從而發揮抗腫瘤作用。比如，TET逆轉人乳腺癌多藥耐藥細胞MCF-7／adr對多柔比星的耐藥［10］；還可逆轉人口腔鱗癌多藥耐藥細胞KBv200對紫杉醇的耐藥［11］。此外，在人食管鱗癌順鉑耐藥細胞YES-2／DDP中，TET還可通過抑制多藥耐藥相關蛋白MRP1，逆轉細胞對順鉑的耐藥［12］。在人腦惡性膠質瘤U138MG中，TET還可以通過增強其放療效果來發揮抗膠質瘤作用［13］。這些TET逆轉耐藥和增效作用的研究為TMZ聯用TET提供了一定理論依據。本研究中，TET聯合運用TMZ處理人腦膠質瘤U87細胞時，比兩藥單用能更好地抑制U87細胞生長、克隆形成和遷移能力等。通過流式細胞儀檢測凋亡，兩者聯合用藥比兩藥單用更能促進U87細胞凋亡。Western蛋白質印跡法檢測凋亡蛋白發現，TET可能通過參與下調細胞內抗凋亡蛋白Bcl-XL，上調活化胱天蛋白酶3，從而剪切的DNA修復酶PARP增多，誘導活化胱天蛋白酶3依賴的細胞凋亡。這其中，兩藥聯用促進U87細胞凋亡作用可能與其下調耐藥相關蛋白有關，尚需要進一步深入研究。因此，在膠質瘤細胞系中，建立多藥耐藥蛋白高表達的細胞株，進一步研究TET對其生物學行為的影響及分子機制顯得更有研究價值。

綜上所述，TET聯合運用TMZ能明顯抑制人腦膠質瘤U87細胞的存活、克隆形成及遷移能力，并誘導胱天蛋白酶3依賴的細胞凋亡。這提示TMZ聯合TET可能成為膠質瘤臨床化療過程中候選治療措施，將提高膠質瘤化療效果和抗膠質瘤治療提供參考。

［1］ Chen YJ．Potential role o f tetrand rine in cancer therapy［J］．Ac ta Pharmacol Sin，2002，23（12）：1102-1106．

［2］ Zheng XF，LiXL，He XP，Xu W，Tang D，Zhang H，e t al．E ffects of tetrand rine in combination w ith paclitaxelon the pro lifera tion and apoptosis of human gastric cancer cell line［J］．Acta Univ Med Nanjing（Nat Sci）〔南京醫科大學學報（自然科學版）〕，2012，32（3）：333-337．

［3］ Chen Y，Chen JC，Tseng SH．Tetrandrine suppresses tumor grow th and angiogenesis of gliomas in rats［J］．Int J Cancer，2009，124（10）：2260-2269．

［4］ SaiK，Yang QY，Shen D，Chen ZP．Chemotherapy for gliomas in mainland China：An overview［J］．Oncol Lett，2013，5（5）：1448-1452．

［5］ Li SY，Ling LH，Teh BS，Seow WK，Thong YH．Anti-inflammatory and immunosuppressive properties of the bis-benzylisoquinolines：in vitro com parisons of tetrandrine and berbam ine［J］．Int J Immunopharmacol，1989，11（4）：395-401．

［6］ W u JM，Chen Y，Chen JC，Lin TY，Tseng SH．Tetrandrine induces apoptosis and grow th suppression of co lon cancer cells inm ice［J］．Cancer Lett，2010，287（2）：187-195．

［7］ Soriano AF，Helfrich B，Chan DC，Heasley LE，Bunn PA Jr，Chou TC．Synergistic effects of new chemopreventive agents and conventional cytotoxic agen ts against human lung cancer cell lines［J］．Cancer Res，1999，59（24）：6178-6184．

［8］ Jang BC，Lim KJ，Paik JH，Cho JW，Baek WK，Suh MH，et al．Te trandrine-induced apop tosis is med iated by activation of caspases and PKC-delta in U937 cells［J］．Biochem Pharmacol，2004，67（10）：1819-1829．

［9］ Oh SH，Lee BH．Induction of apoptosis in human hepatoblastoma cells by tetrandrine via caspasedependent Bid c leavage and cytochrome c release［J］．Biochem Pharmacol，2003，66（5）：725-731．

［10］ Fu LW，Zhang YM，Liang YJ，Yang XP，Pan QC．The multidrug resistance of tumour cells was reversed by tetrandrine in vitro and in xenografts derived from human breast adenocarcinoma MCF-7／adr cells［J］．Eur JCancer，2002，38（3）：418-426．

［11］ Zhu X，SuiM，Fan W．In vitro and in vivo characterizations o f tetrandrine on the reversalof P-glycoprotein-mediated drug resistance to paclitaxel［J］．Anticancer Res，2005，25（3B）：1953-1962．

［12］ Wang TH，Wan JY，Gong X，Li HZ，Cheng Y．Tetrandrine enhances cytotoxicity of cisplatin in human drug-resistant esophageal squamous carcinoma cells by inhibition ofmultidrug resistance-associated protein 1［J］．Oncol Rep，2012，28（5）：1681-1686．

［13］ Chang KH，Chen ML，Chen HC，Huang YW，W u TY，Chen YJ．Enhancement of radiosensitivity in hum an glioblastom a U138MG ce lls by tetrandrine［J］．Neop lasma，1999，46（3）：196-200．

lnhibito ry effect o f tem ozo lom ide com bined w ith tetrand rine on hum an g liob lastom a U87 cells

OBJECTlVETo observe the e ffect o f tem ozo lom ide（TMZ）in com bination w ith tetrand rine（TET）on cell viability，colony formation，m igration and ce ll apoptosis of human g lioblastom a U87 ce lls．METHODSThe viability o f U87 ce lls treated w ith TET（8－64μm o l·L－1），TMZ（50－400μm o l·L－1）and TMZ com bined w ith TET（3．2，6．4μm o l·L－1）was detected by cytotoxicity assays w ith Cell Counting Kit-8（CCK-8），the co lony form ation was detected by Giem sa staining，ce llm igration ability was detected by Transwellm igration assay，cell apoptosis was assayed by flow cytometry using AnnexinⅤ／PIdouble staining，and the expression of apoptosis-related proteins expression was detected by Western blotting．RESULTSThe data of CCK-8 showed that TET（r＝0．903，P＜0．05）or TMZ（r＝0．995，P＜0．05）could inhibitU87 cellviability alone in a concentration-dependentmanner．The cell viability inhibition rate of U87 ce lls by TMZ combined w ith TET was higher than by TMZ or TET a lone．Data showed that the e ffect o f TMZ combined w ith TET was additive．TMZ 100μm ol·L－1inhibited U87 ce ll co lony formation and m igration ab lility com pared w ith norm a l contro l．The inhibition rate o f U87 cells by TMZ 100μmo l·L－1com bined w ith TET（3．2 and 6．4μm ol·L－1）was m ore significant than by TMZ a lone（P＜0．05）．Compared w ith TMZ a lone，TMZ com bined w ith TET（3．2 and 6．4μm o l·L－1）significantly down-regulated the expression of anti-apoptotic protein Bcl-XL，but significantly up-regulated the expression of cleaved caspase 3 protein and cleaved poly（ADP-ribose）polymerase．CONCLUSlONTET combined with TMZ can inhibit U87 cell viability，colony formation and m igration by activating caspase-dependent apoptotic pathway，resulting in apoptosis．

tetrand rine；tem ozo lom ide；U87 cells；apop tosis

ZHONG Xue-yun，E-mail：tzxy＠jnu．edu．cn，Tel：（020）85228363

ZHANG Yong1，2，MA Ji-wei1，2，LIU Hai-ying1，2，WANG Shao-Xiang1，2，3，YAN Yong-rong1，2，LIU Zi-hao1，2，DU Bin1，2，ZHONG Xue-yun1，2

（1．Departm ent o f Patho logy，Medica l Co llege，2．Guangdong Provincia l Key Laboratory o f Mo lecu lar Immunology and Antibody Engineering，3．Guangzhou Jinan Biomedicine Research and Development Center，Guangdong Provincial Key Laboratory of Bioengineering Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

R285，R966

：1000-3002（2014）03-0367-06

Foundation item：The project supported by NationalNatural Science Foundation of China（81072059）；and Science and Technology Innovation Key Project of Guangdong Higher Education Institutes（CXZD1110）

2013-11-06 接受日期：2014-03-12）

（本文編輯：喬 虹）

國家自然科學基金項目（81072059）；廣東省高等學校科技創新重點項目（CXZD1110）

張 勇，碩士，主要從事腫瘤病理及膠質瘤干細胞相關耐藥機制研究。

鐘雪云，E-mail：tzxy＠jnu．edu．cn，Tel：（020）85228363