T-2毒素對小鼠胚胎干細胞線粒體功能的抑制作用

方海琴，李利忠，趙增明，何 俊，趙 君，楊 嶸，耿 雪，彭雙清

（1．軍事醫學科學院疾病預防控制研究所毒理學評價研究中心，北京 100071；2．國家食品安全風險評估中心衛生部食品安全風險評估重點實驗室，北京 100021）

T-2毒素對小鼠胚胎干細胞線粒體功能的抑制作用

方海琴1，2，李利忠1，趙增明1，何 俊1，趙 君1，楊 嶸1，耿 雪2，彭雙清1

（1．軍事醫學科學院疾病預防控制研究所毒理學評價研究中心，北京 100071；2．國家食品安全風險評估中心衛生部食品安全風險評估重點實驗室，北京 100021）

目的觀察T-2毒素對小鼠胚胎干細胞（m ESC）線粒體功能的毒性作用，探討其胚胎毒性的可能作用靶點與作用機制。方法處于分化過程中的m ESC加入T-2 0．5μg·L－1分別作用24，72及120 h，同時設Trolox 200μmol·L－1預處理后30 m in再加入T-2毒素0．5μg·L－1染毒72 h組。透射電子顯微鏡觀察線粒體內結構；羅丹明123熒光探針法流式細胞術檢測mESC內線粒體膜電位，氧電極法檢測線粒體呼吸速率，計算呼吸控制比，熒光素-熒光素酶發光法測定ATP合成酶活性。結果透射電鏡觀察可見，T-2 0．5μg·L－1作用72與120 h組m ESC內線粒體數量明顯減少，結構變形，線粒體中少見或缺少完整的嵴，與正常對照組相比，mESC內線粒體呼吸控制比分別下降49．5%和55．1%（P＜0．05），ATP合成酶活性分別下降84．9%和89．3%（P＜0．05），m ESC線粒體膜電位下降23．2%和35．2%（P＜0．05）。Trolox預處理可以改善T-2毒素對上述線粒體功能指標的抑制作用。結論T-2毒素可降低m ESC的線粒體功能，進而抑制m ESC的分化能力，可能是其胚胎發育毒性的作用機制之一。

T-2毒素；毒性作用；胚胎干細胞；線粒體；細胞分化

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．03．018

T-2毒素是一種由三線鐮刀菌產生的單端孢霉烯族毒素，廣泛分布于自然界，尤其對糧谷作物的污染范圍廣程度重。經食物連續攝入T-2毒素會對人類和動物的健康造成嚴重危害，表現出對生殖發育系統的母體毒性和胎仔毒性，可導致胚胎發育異常，甚至死亡［1－2］。

胚胎干細胞實驗（embryonic stem cell test，EST）作為歐洲替代方法驗證中心（European Centre for the Va lidation o f Alternative Methods，ECVAM）正式批準為體外發育毒性篩選的動物替代方法，EST可以從細胞毒性、分化抑制以及分子生物學水平反映發育毒性，其中受試物對ESC向心肌細胞分化的半數抑制濃度ID50可反映受試物對胚胎干細胞（em bryonic stem ce ll，ESC）分化過程的影響［3－5］，本課題前期應用EST評價T-2毒素為強發育毒性化合物，并得出T-2毒素對ESC的半數抑制濃度為0．57μg·L－1［6］。

ESC在分化過程中，氧耗與供能方式發生改變，即從糖酵解向需氧代謝轉換，因此，線粒體的功能對于ESC的分化能力發揮重要作用。已有報道，在ESC自發分化為多種細胞的過程中，發現線粒體DNA的含量和分化的相關性，線粒體DNA數量隨著干細胞分化程度的增加而增加，線粒體數目和形態結構發生變化［7－9］；以及過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α和活性氧（reactive oxygen species，ROS）對線粒體的調控在ESC向心肌細胞的分化，線粒體功能在多能干細胞和細胞重編程中皆發揮著重要的作用［10－11］。

本研究將通過建立ESC分化模型來作為胚胎毒性測試體外替代模型，從細胞和分子機制來探討T-2毒素發育毒性作用機制，重點關注T-2毒素在抑制分化作用濃度下對小鼠ESC線粒體功能的影響。

1 材料與方法

1．1 細胞、試劑和主要儀器

小鼠ESC-D3細胞（murine embryonic stem cell，mESC）購自中國科學院上海生物細胞研究所。T-2毒素由軍事醫學科學院疾病預控制研究所毒理學評價研究中心提供。knockout-DMEM培養基（Du lbecco′s modified Eagle medium）、高糖DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），β-巰基乙醇、非必需氨基酸（NEAA）、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、L-谷氨酰胺，青鏈霉素雙抗和Trizol均購自德國Invitrogen Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲亞砜（DMSO）和明膠購自美國Sigma公司。小鼠白血病抑制因子（murine leukem ia inhibitory factor，m LIF）購自美國Chem icon公司。BCA法蛋白質定量試劑盒購自北京普利來生物公司。2′，7′-二氯熒光素〔2′，7′-dichlorofluorescineiacetate（H2-DCFDA）〕、羅丹明123、ADP、地高辛、蘋果酸、谷氨酸均購自美國Sigma公司，ATP合成酶活力試劑盒（PROMEGA ENLITEN?Total ATP Rapid Biocontamination Detection Kit）購自美國Promega公司。

1．2 細胞培養及處理

10 mg T-2毒素溶于1 m L DMSO，配成濃度10 g·L－1的母液，每管50μL分裝凍存，用時按需用培養基倍比稀釋。Tro lox溶解于10 m L超純水配制成濃度2 mmol·L－1儲液，過濾除菌后4℃保存，染毒時用無血清培養基稀釋至200μmo l·L－1。

m ESC培養與分化處理按文獻描述［6，12］，懸滴3 d、轉懸浮2 d生成擬胚體（embroynic body，EB），分別在EB貼壁24，72和120 h后加入T-2毒素，作用濃度為0．5μg·L－1。按照處理時間分組為正常對照組、T-2毒素給藥24，72和120 h組。此外，按給藥30 m in前Trolox預處理分為單純Trolox預處理組、Trolox預處理后T-2毒素0．5μg·L－1染毒72 h組。

1．3 透射電子顯微鏡觀察分化m ESC內線粒體結構

收集細胞，鋨酸固定，乙醇梯度脫水，環氧丙烷置換，環氧樹脂包埋，切片，采用PhilipsEM208s型透射電子顯微鏡觀察，攝片。每組細胞采用3張切片，低倍鏡下進行全面細致的觀察后8000倍放大倍數下拍照，即在選定的每張切片上隨機拍攝細胞內照片各5張。

1．4 線粒體膜電位的測定

收集指數生長期細胞，重懸細胞后，加入羅丹明123染液10 m g·L－1；37℃，5%CO2細胞培養箱孵育30 m in；4℃下800×g離心10 m in，培養基洗細胞2次，PBS重懸；激發波長488～505 nm，發射波長530 nm。以相應熒光探針熒光讀數的對數為橫坐標，細胞數為縱坐標即可測定m ESC線粒體膜電位的相對強度。

1．5 極譜法［13］測定線粒體呼吸速率

收集細胞，細胞計數，細胞數量為1×105。反應體系3 m L，25℃恒溫，以90%速度攪拌。反應介質為（mmol·L－1）：KCl130，HEPES 10，EDTA 1，KH2PO42．5，去脂牛血清蛋白1．5 mg，pH 7．4。加入蘋果酸0．1 mmol·L－1和谷氨酸1 mmol·L－1啟動態4（ST4）呼吸。平穩后加入200 nmol ADP啟ST3呼吸速率。ADP耗盡后重又回到ST4。記錄儀記錄耗氧曲線，通過曲線測定ST4和ST3呼吸，并計算出呼吸控制比（respiratory control rate，RCR）（ST3／ST4）。

1．6 線粒體ATP合成酶活性的測定

收集細胞，細胞數量為1×105，用線粒體呼吸介質重懸，反應溫度為25℃，在0．5 m L反應體系（mmol·L－1）中含有HEPES 10，EDTA 0．5，磷酸緩沖液5，蘋果酸6，MgCl22．5，反應溫度為25℃，在0．5 m L反應體系中含有（mm o l·L－1）HEPES 10，EDT 0．5，磷酸緩沖液5，蘋果酸6，MgCl22．5，記錄以上體系的發光強度為本底，加入4μL ADP啟動反應，記錄發光強度。在不加細胞和ADP的平行實驗中，加入ATP 1 nm o l·L－1，記錄發光強度，標定ATP合成量。

1．7 統計學分析

2 結果

2．1 T-2毒素對m ESC的線粒體結構的影響

透射電鏡顯示（圖1），正常對照組的m ESC分化后，細胞內線粒體豐富，形態正常，線粒體內可見結構完整的嵴（圖1A）；T-2毒素0．5μg·L－1干預后，隨時間變化，線粒體數量與質量發生改變，T-2毒素0．5μg·L－1作用24 h線粒體數目未見減少（圖1B），而在72與120 h組，可見線粒體數目的明顯減少，同時可見線粒體變形，線粒體中少見或缺乏完整的嵴（圖1C，D），提示T-2毒素0．5μg·L－1的長期干預會抑制線粒體生成的數量與功能。

2．2 T-2毒素對m ESC線粒體膜電位的影響

結果如圖2所示，在T-2毒素作用下，m ESC線粒體膜電位呈時間依賴性下降，表現為膜電位曲線左移（圖2A1）。T-2毒素0．5μg·L－1分別作用72和120 h，m ESC線粒體膜電位分別下降23．2%和35．2%（圖2A2），差異具有統計學意義（P＜0．05）。Trolox預處理后導致m ESC線粒體膜電位下降減小，膜電位曲線明顯右移（圖B1和B2），具有統計學意義（P＜0．05）。

Fig．1 Effec t o f T-2 tox in on m itochond ria l u ltrastruc tu re o f m u rine em b ryonic stem cells（m ESCs）by transm ission elec trica lm ic roscope．A：norm al control group；B，C and D：ESCs were treated w ith T-2 0．5μg·L－1for 24，72 and 120 h，respectively．Arrows show m itochondria in differentiated m ESCs．

Fig．2 Effec t o f T-2 tox in on m itochond ria lm em b rane po ten tial（△Ψ）o f m ESCs．A1 and A2：ESCs were treated w ith T-2 0．5μg·L－1for 24，72 and 120 h；B1 and B2：ESCs were pretreated with Trolox 200μmol·L－1for30 m in，then exposed to T-2 toxin 0．5μg·L－1for 72 h．，n＝3．*P＜0．05，compared with normal controlgroup；＃P＜0．05，com pared w ith Trolox group

2．3 T-2毒素對m ESC線粒體呼吸速率的影響

結果如圖3所示，T-2毒素對m ESC的RCR有顯著影響（圖3A）。T-2毒素作用72與120 h，其RCR值分別下降49．5%與55．1%（P＜0．05）（圖3B）。經Tro lox預處理后m ESC線粒體呼吸控制比仍明顯下降，但與單純T-2毒素作用比較，mESC中線粒體呼吸控制比顯著增加，約增加31%（圖3C），差異具有統計學意義（P＜0．05）。

2．4 T-2毒素對mESC線粒體ATP合成酶活性的影響

結果如圖4所示，T-2毒素對mESC線粒體的ATP合成酶活性有顯著的抑制作用。與對照組相比，各實驗組都表現出顯著性差異，T-2毒素作用24，72和120 h ATP合成酶活性分別下降25．5%，84．9%和89．3%（圖4A）。經Trolox預處理后mESC線粒體合成酶活性仍明顯下降，但與單純T-2毒素作用比較，m ESC中線粒體合成酶活性顯著增加，約增加2倍（圖4B），差異具有統計學意義（P＜0．05）。

Fig．3 Effect o f T-2 toxin on respiratory contro l ratio（RCR）o fm itochond ria o fm ESCs．A，B：ESCs were treated w ith T-2 0．5μg·L－1for 24，72 and 120 h．C：ESCs were pretreated w ith Trolox 200μmol·L－1for 30 m in，then exposed to T-2 toxin 0．5μg·L－1for 72 h．Dig：digitonin；M＋G：m alage＋glutate．，n＝3．*P＜0．05，com pared w ith normal control group；＃P＜0．05，compared w ith Trolox group．

Fig．4 Effect o f T-2 toxin on ATP synthesis activity o fm ESCs．A：ESCs were treated with T-2 0．5μg·L－1for 24，72 and 120 h．B：ESCs were pretreated with Trolox 200μmol·L－1for30 min，then exposed to T-2 toxin 0．5μg·L－1for72 h．，n＝3．*P＜0．05，compared with normal controlgroup；＃P＜0．05，com pared w ith Trolox group．

3 討論

ESC分化時有較高的能量要求，分化過程中耗氧與供能方式發生轉變，即從糖酵解供能到有氧氧化的轉變，線粒體由一種相對較低的活動狀態向較高的呼吸功能轉化［14－15］。此變化類似于胚胎發育中的線粒體受到體內環境的影響，線粒體的活性和分布狀況會隨著胚胎發育時期的不同而改變［16－17］。本研究觀察到在未分化ESC中線粒體的數目以及嵴都較貧乏，而ESC分化時其發生急劇變化，表現為嵴豐富，數目增加，這與文獻報道一致，T-2毒素干預后，ESC內線粒體數目減少，且形態異常，線粒體嵴缺少，提示T-2毒素干預抑制分化的ESC線粒體功能。

Esteban等［18］報道，線粒體膜電位在誘導多能干細胞（induced p luripotent stem ce lls，iPSC）獲得多能性的重編程過程中發生了變化。ATP的合成要靠呼吸鏈不斷供給質子以維持一個強大的質子電化學梯度，并經線粒體ATP合成酶的作用將能量轉換用于合成ATP，ROS可導致線粒體內膜通透性增加，通透性增加將不能維持質子電化學梯度［13，17］。本研究發現，T-2毒素導致m ESC線粒體功能下降呈時間依賴效應關系，表現為線粒體呼吸速率比下降、膜電位下降及ATP合成酶活性下降。

m ESC分化時需要線粒體功能增加以適應其供能需求與氧耗方式的轉變，我們在前期研究中發現T-2毒素可以致分化m ESC內ROS生成增加［6］，推測在長時間的ROS作用下，線粒體呼吸鏈復合體活力降低，電子傳遞鏈功能下降，電子傳遞受阻，使電子漏增加，電子漏的增加進一步導致自由基的增加，線粒體ROS的生成與清除進一步失衡；過量ROS引發線粒體的自身氧化，線粒體內膜的完整性被破壞，進而引起線粒體膜電位的改變，膜電位的下降又進一步使得ATP生成得到抑制，ATP生成的減少使ESC細胞能量供應降低，進而分化所需能量供給不足，最終表現出抑制ESC的分化，同時也造成線粒體功能降低與氧化損傷的惡性循環。為了進一步證實T-2毒素對m ESC線粒體功能影響的作用機制，本研究選擇自由基清除劑Trolox對m ESC進行預處理，結果發現ROS的下降導致線粒體功能在一定程度上得到恢復。由此可見，T-2毒素對線粒體功能的影響與T-2毒素導致ROS的生成有關，其對m ESC線粒體功能的抑制可能是產生發育毒性的作用機制之一。

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T-2 toxin inhibits m itochond rial func tion o f d ifferen tiated m u rine em b ryonic stem cells

FANG Hai-qin1，2，LILi-zhong1，ZHAO Zeng-m ing1，HE Jun1，ZHAO Jun1，YANG Rong1，GENG Xue2，PENG Shuang-qing1
（1．Evaluation and Research Center for Toxicology，Institute of Disease Prevention and Control，Academy o f M ilitary Medica l Sciences，Beijing 100071，China；2．Key Laboratory o f Food Sa fety Risk Assessm ent o f Ministry of Hea lth，China Nationa l Center for Food Safety Risk Assessm ent，Beijing 100021，China）

OBJECTlVE To exp lore the possib le m echanism or action targets of T-2 toxin em bryo toxicity by observing the effect of T-2 toxin on m itochondrial function of differentiated murine embryonic stem cells（m ESCs）．METHODS During differentiation at24，72 and 120 h，ESCs were exposed to T-2 toxin 0．5μg·L－1．Meanwhile，m ESCs were pre-treated with antioxidant Trolox（200μmol·L－1）for 30 m in and exposed to T-2 toxin（0．5μg·L－1）for 72 h．The m itochondrial ultrasture of differentiated m ESCs was observed under a transim ission electricalm icroscope（TEM）．The differentiated ESC m itochond ria l function，inc luding respiratory contro l ratio（RCR），ATP synthase activity and m itochondria l m embrane potentia l（MMP），was measured at 144 h a fter differentiation．RESULTS Significant decrease of the m itochondria lnumber，de formation o fm itochond ria lstructure，and lack o f comp lete m itochod rial crestwere observed through TEM in the groups o f T-2 toxin exposed for 72 and 120 h，respectively．Compared with the normal control group，RCR declined by 49．5%and 55．1%，ATP synthase activity decreased by 84．9%and 89．3%，and MMP decreased by 23．2%and 35．2%in T-2 toxin 0．5μg·L－1exposure 72 and 120 h group，respectively．However，the inhibition ofm itochondrial function by T-2 toxin in differentiated m ESCs recovered significantly in the presence of the antioxidant Trolox．CONCLUSlON T-2 toxin induces oxidative stress and inhibitsm ESCsm itochondrial function in differentiated m ESCs，and ROS-induced m itochondria lm a lfunction p lays an im portant ro le in T-2 toxin em bryonic toxicity m echanism．

T-2 toxin；toxic actions；embryonic stem ce lls；m itochond ria l；ce ll differentiation

PENG Shuang-qing，E-mail：pengsq＠hotmail．com，Tel：（010）66948462

R394．1

A

1000-3002（2014）03-0415-06

Foundation item：The project supported by International Cooperation Project from Ministry of Science and Technology of China（2011DFA32190）；National Natural Science Founda tion of China（81172699）；National Natural Science Foundation of China（81302462）；and Natural Science Foundation of Beijing City（7142128）

2014-01-02 接受日期：2014-05-10）

（本文編輯：喬 虹）

國家科技部國際合作項目（2011DFA32190）；國家自然科學基金項目（81172699）；國家自然科學基金項目（81302462）；北京市自然科學基金資助項目（7142128）

方海琴（1977－），女，博士，助理研究員，主要從事食品毒理學研究；彭雙清（1962－），男，博士，研究員，博士生導師，主要從事化學物安全性評價研究。

彭雙清，E-mail：pengsq＠hotm ail．com，Tel：（010）66948462