石油脫硫菌的篩選與培養基優化*

張 虹 汪 洋 袁紅梅 尤鳳麗 黃永紅

大慶師范學院

石油脫硫菌的篩選與培養基優化*

張 虹 汪 洋 袁紅梅 尤鳳麗 黃永紅

大慶師范學院

生物脫硫（BDS）技術具有選擇性高、反應條件溫和、設備投資和操作費用低等優點，是實現燃料油深度脫硫最有效的技術之一。實驗分離得到6株可降解DBT的脫硫菌，經比較確定了B5為高效脫硫菌株，需進一步進行菌種鑒定。對B5菌株的脫硫條件進行優化，確定脫硫最佳培養基是葡萄糖作碳源、牛肉膏作氮源，最佳接種量為8%，最佳DBT的含量為20mg/L，最佳pH值10、溫度30℃，最佳菌齡3天，裝液量在最少的時候脫硫效果最好。

脫硫菌；菌株；培養基；優化；接種量；脫硫效果

傳統的物理和化學脫硫方法（HDS）存在著脫硫不完全、成本高和操作費用高等缺點[1-2]。相比之下生物脫硫（BDS）技術具有選擇性高、反應條件溫和、設備投資和操作費用低等優點，是實現燃料油深度脫硫最有效的技術之一[3]。在脫硫微生物篩選過程中，DBT是公認的脫有機硫模式化合物，據此分離出來的菌種可有效脫出有機硫，且不破壞C—C結構，從而保留了燃料的熱值[4]

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣本材料取自大慶煉化公司聚合物二廠未被排除的工業廢水。實驗器材包括壓力蒸汽滅菌鍋（TOMY ES—315），721型紫外分光光度計，振蕩培養箱（HZQ—F160），超凈工作臺（VS—1300L—U），離心機（Allegra64R）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的富集與分離

取10 mL水樣加到90 mL的NB培養基中，30℃，200 r/min培養3 d后，從中取2.5mL的上清液加到50mLBSM培養基的三角瓶中，相同培養條件培養后，將菌液制備成梯度稀釋液（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍），逐一標記，分別取0.1mL稀釋液加到BSM固體平板上，28～30℃恒溫培養2～3 d至菌落出現。

挑取不同形態的單菌落采用劃線分離法反復進行分離純化，直到得到單菌株的純培養物，純化菌株保存于LB斜面培養基上，4℃冰箱保存。

1.2.2 菌株降解效果的測定

挑取單菌落接入裝有5mLNB培養液的試管內，30℃，150 r/min搖床培養24 h作為種子液。取lmL種子液接入裝有50mLBSM2培養基的250mL三角瓶中，30℃，250 r/min搖床培養72 h，用10%的Na2C03溶液將菌種發酵液調pH值為8.0，5 000 r/min離心10min除菌體，取上清4mL，加入Gibb’s試劑40μL，混勻，30℃反應30min后，測其在610 nm處吸光度，代入回歸方程測出2 HBP含量。

1.2.3 脫硫菌脫硫條件的優化

（1）培養基的優化。以BSM培養基為基礎培養基，分別取5 g/L葡萄糖、2.5 g/L蔗糖、6 mL/L乙醇、8mL/L甘油、4 g/L乙酸鈉和1.2 g/L檸檬酸鈉作為碳源，72 h培養后用紫外分光光度計測定并計算2—HBP含量，確定最適宜的碳源。以最佳碳源作為BSM碳源，分別取2.5 g/L NH4Cl、2 g/L NH4O3、5 g/L KNO3、10 g/L牛肉膏和25 g/L蛋白胨作為氮源，72 h培養后測定菌體產生2—HBP量，確定最適宜的氮源。

（2）培養條件的優化。培養基選取最佳碳源和氮源，以DBT為唯一硫源，以2%、4%、6%、8%、10%的接種量培養72 h。通過測定菌體產生的2—HBP量確定最佳接種量。在最佳碳源、氮源和接種量的培養基中添加濃度為20、40、60、80和100mg/L的DBT，培養72 h確定最佳的DBT濃度。最佳培養基中設置6、7、8、9、10不同pH值，培養72 h確定最佳的pH值。設置20、25、30、35、40℃不同溫度，培養72 h確定最佳溫度。選取冰箱保存的菌株活化培養2、3、4、5天，將不同菌齡的菌分別接種于最佳培養基，培養72h確定最佳菌齡。設置不同裝液量，即每個250mL三角瓶分別裝液體培養基40、50、60和70mL，培養72 h，研究通氣量狀況對菌體脫硫影響。

2 結果與分析

2.1 脫硫菌的富集與分離

對煉化公司聚合物二廠工業廢水進行系列稀釋與劃線分離，在BSM平板上得到優勢菌6株，分別為B1～B6。菌落形態見表1。

表1 菌落形態特征

2.2 菌株降解效果的測定

篩選得到的6株菌在以DBT為唯一硫源的BSM2培養基中發酵培養，產物與Gibb’s試劑在堿性環境中均可生成藍色復合物[5]，證明產物含2—HBP。利用分光光度計測出這幾種菌在610 nm處的吸光度，代入回歸方程計算生成2—HBP量，以判定菌體脫硫能力的高低。通過不同菌株的降解效果對比可知，菌株B5的2—HBP濃度最高，說明B5脫硫效果最好。

2.3 脫硫菌培養條件的優化

2.3.1 培養基的優化

碳源分別是葡萄糖、蔗糖、乙醇、乙酸鈉、甘油和檸檬酸鈉時B5的脫硫情況表明，該菌在幾種碳源作用下均可脫硫，但葡萄糖作碳源時，菌體脫硫效果最好，最高可產生7.97 mg/L的2—HBP。

從不同氮源對菌B5脫硫效果可看出，菌體在牛肉膏作氮源時最高可產生1.56mg/L的2—HBP。

2.3.2 培養條件的優化

從不同接種量對菌B5脫硫效果的影響可以看出，接種量小，脫硫效果不好；隨著接種量的增高，脫硫效果有所提高，但接種量達8%以后，隨著接種量的增加，脫硫效果反而有所下降。接種量大容易造成雜菌污染[6]，因此最佳接種量為8%，可產生2.23mg/L的2—HBP。

從不同DBT濃度對菌B5脫硫效果的影響可見，濃度為20mg/L時，B5最高可產生0.973mg/L的2—HBP，顯示這時脫硫效果最好；隨著DBT濃度的增高，脫硫有所減弱，在80mg/LDBT濃度以后脫硫效果隨著DBT濃度的增加大幅下降，分析可能與脫硫底物抑制物有關。

從不同pH值對菌B5脫硫效果的影響可見，脫硫效果在pH值為8時最好，可生成3.164 12mg/L的2—HBP。

從不同溫度（20、25、30、35、40℃）對菌株B5脫硫影響可見，溫度太高或太低都不利于菌的脫硫效果；在30℃時，2—HBP產生量可達最大值，為4.569mg/L。

從不同菌齡的菌株（2、3、4、5天）對B5脫硫效果的影響可見，活化3天以后的菌株脫硫效果最好，可產生5.47mg/L的2—HBP。

裝液量的大小主要影響培養過程中的通氣及溶氧情況，從不同裝液量（40、50、60、70mL）對菌株B5脫硫效果的影響可見，菌株的脫硫效果隨著裝液量的增多而減弱，這與好氧菌培養特點一致。

根據以上優化實驗結果，配置以葡萄糖為碳源、牛肉膏為氮源的培養基，選擇3天菌齡的菌株，按8%比例接種，裝液量40 mL，在pH值為8、溫度30℃的培養條件下研究脫硫狀況。實驗發現，B5菌株在前兩天脫硫效果不好；從第4天起，脫硫效果明顯增強，最高可產生13.12mg/L的2—HBP；但一周以后脫硫效果沒有明顯上升，結果與優化預期結果一致。

3 結論

（1）實驗分離得到6株可降解DBT的脫硫菌，經比較確定了B5為高效脫硫菌株，需進一步進行菌種鑒定。

（2）對B5菌株的脫硫條件進行優化，確定脫硫最佳培養基是葡萄糖作碳源、牛肉膏作氮源，最佳接種量為8%，最佳DBT的含量為20mg/L，最佳pH值10、溫度30℃，最佳菌齡3天，裝液量在最少的時候脫硫效果最好。

[1]田曉娟，唐凌天，彭立娥，等．石油脫硫微生物菌株的篩選及鑒定的研究[J]．地學前緣，2008，15（6）：192-198.

[2]杜長海，馬智，賀巖峰，等．生物催化石油脫硫技術進展[J]．化工進展，2002，21（8）：569-571.

[3]馬艷，劉成，鄒少蘭，等．石油微生物脫硫的研究進展[J]．工業微生物，2007，37（2）：57-63.

[4]楊宇，刁夢雪，師舞陽．油田土壤中脫除有機硫菌株的分離與鑒定[J]．生態環境，2006，15（5）：1 009-1 013.

[5]張娟，李清雪，陳春燕．高效脫硫菌的篩選及脫硫性能研究[J]．河北建筑科技學院學報，2006，23（1）：5-7.

[6]侯影飛，孔瑛，楊金榮，等．石油生物脫硫菌UP—1培養及反應條件的優化[J]．2005，29（1）：111-115.

（欄目主持楊軍）

10.3969/j.issn.1006-6896.2014.6.003

基金論文：黑龍江省教育廳自然基金項目“大慶油田石油脫硫微生物激勵研究”（11523001）。