脛骨神經損傷對骨折愈合過程中CGRP表達的影響

吳洪亮李宗澤

（1 南昌大學第四附屬醫院關節外科，江西 南昌 330003；2 江西省瑞金市人民醫院骨科，江西 瑞金 342500）

脛骨神經損傷對骨折愈合過程中CGRP表達的影響

吳洪亮1李宗澤2

（1 南昌大學第四附屬醫院關節外科，江西 南昌 330003；2 江西省瑞金市人民醫院骨科，江西 瑞金 342500）

目的 研究脛骨神經損傷后大鼠脛骨骨折骨痂中CGRP的表達。方法 將SD大鼠40只分為2組，實驗組20只和對照組20只，分別于骨折術后7、14、21、28 d處死大鼠，在骨折處取骨痂標本，觀察脛骨骨折愈合過程中脛骨神經損傷時降鈣素基因相關肽（CGRP）表達變化。結果 對照組骨折后7 d在愈傷組織中即可見到降鈣素基因相關肽（CGRP）陽性神經纖維，沿血管分布，14～21 d在編織骨邊緣有大量的CGRP陽性神經纖維，28 d時仍有較高水平。研究組除骨折后7 d骨痂中見CGRP陽性表達外，以后骨痂中CGRP表達逐漸下降，其中術后14、21、28 d兩組組間CGRP表達量比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論 在骨折愈合過程中，骨折合并周圍神經損傷不利于骨折愈合，周圍神經對骨折的愈合起著重要的調節作用。

神經損傷；骨折愈合；降鈣素基因相關肽

近年來，研究發現在骨折愈合過程中周圍神經系統起到了重要的作用[1]，其主要通過肽能神經分泌的相關神經肽對骨組織起作用[2]，而CGRP在骨組織中分布最廣，并且主要分布在骨代謝活躍的部位。CGRP通過調節成骨細胞和破骨細胞的分化及活性，從而影響骨折愈合。本實驗通過對40只SD大鼠建立失神經支配的脛骨骨折模型，研究外周神經對脛骨骨折愈合的影響，為改善神經功能促進骨折愈合提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及模型建立：選取SD成年健康大鼠40只，體質量300 g左右，雌雄不限，隨機數字表法分成2組：左側脛骨骨折組+左側脛骨神經損傷組（實驗組，20只）和單純左側脛骨骨折組（對照組，20只）。各組大鼠均用10%水合氯醛350 mg腹腔注射麻醉。A組在無菌條件下從脛骨平臺前緣插入一根預制的消毒醫用克氏針，然后人工固定大鼠后肢。助手將重錘于30 cm高處沿中軸自由落下，通過撞擊托盤將力傳導至刀片上，撞擊脛骨中段造成骨折，脛骨中段前方最高點處為暴力撞擊點，建立左側脛骨骨折模型[3]。B組常臀部規備皮消毒后，外側行長約1.5 cm的斜形切口，切開皮膚及皮下組織，將坐骨神經鈍性分離，于梨狀肌出口以遠1 cm處橫斷切除坐骨神經遠段約0.5 cm，生理鹽水沖洗傷口后在皮下進行遠端翻轉縫合，建立左側脛骨骨折合并脛骨神經損傷模型[4]。術后將所有實驗動物分籠喂養，并注意保溫，術后連續3 d肌內注射青霉素，每日3次。為防止感染，局部應用碘伏消毒傷口。自來水、市售固體飼料喂養。

1.2 骨痂標本制?。焊鹘M大鼠分別于建立實驗模型后7、14、21、28 d，截取脛骨骨折部上下5 mm部位的組織，同時保護好骨膜，避免破壞骨痂。去盡軟組織后用4%多聚甲醛固定液固定24～48 h，用10%乙二胺四乙酸鈉充分脫鈣。至針頭輕易扎穿骨皮質后，梯度乙醇脫水，二甲苯置換，石蠟包埋，連續縱行4 μm組織切片，附著于載玻片上置入4 ℃的冰箱中備用。

1.3 X線片檢查：分別于術后7、14、21、28 d對各組動物骨折側行X線攝片檢查，嚴格控制拍片條件：55 kv，10 ms，1.6 mAs，焦距90 cm。觀察各組動物骨折處的骨痂生長情況。

1.4 HE染色組織學觀察：將切片放入二甲苯中將石蠟除去，再經95%乙醇到80%乙醇，最后用蒸餾水沖洗。用蘇木精水溶液染色10 min，自來水沖洗5 min，鏡檢，若胞質過藍則以1%鹽酸酒精分化30 s，自來水沖洗5 min。伊紅染液染色5 min，若胞質過紅則以無水酒精分化數秒鐘，自來水沖洗。切片經梯度酒精脫水，再次放入二甲苯中，使切片透明。將中性樹膠滴在透明切片上，蓋上蓋玻片封固。光鏡下觀察細胞核呈蘭色，細胞質呈紅色。觀察骨細胞數量和骨小梁排列。

1.5 免疫組化檢測CGRP的表達：采用SP法，石蠟切片脫蠟至水，在室溫下，3%過氧化氫孵化10 min，蒸餾水清洗3次，復合消化液消化20 min抗原修復，滴加正常山羊血清封閉在室溫下20 min，倒掉血清。滴加一抗工作液置于濕盒內4 ℃過夜，次日再置于37 ℃中1 h。滴加二抗工作液37 ℃孵育20 min，滴加鏈霉卵白素37 ℃孵育30 min。最后用新鮮配制的DAB液顯色，蘇木精再次染色，常規脫水透明，中性樹膠封片封片，鏡檢。

1.6 統計學處理及圖像分析：應用統計軟件SPSS16.0進行統計分析，所有數據均采用均數±標準差（）表示。計量資料使用兩樣本t檢驗進行統計學分析處理，

2 結 果

2.1 大體觀察：所有動物術后給予青霉素肌注、碘伏消毒傷口，飼養盒單獨喂養，所有大鼠均無1例感染。但對照組傷口愈合速度實驗組快，實驗組術后腫脹程度及比對照組重，而且持續時間長。

2.2 X線檢查結果：X射線檢測，術后7天兩組均無明顯骨痂生長，斷端清晰明確；術后14 d兩組骨折端均出現局部高密度影，附近存在骨膜反應，骨痂量實驗組較多，部分突出于骨皮質表面，但密度較差且不均勻；術后21 d實驗組骨痂量較多，部分繼續增大突出，但對照組正常生長，密度較實驗組均勻；術后28 d實驗組骨架過度生長，明顯突出正常骨皮質，密度不均，外骨痂吸收塑形差，對照組骨折線模糊消失，外骨痂塑形逐漸成熟，密度較均勻，基本接近正常骨皮質。

2.3 免疫組織化學觀察：對照組術后7 d骨痂組織中即可見CGRP陽性表達，沿血管分布；術后14、21 d均有大量CGRP免疫陽性神經纖維分布，術后21 d較術后14 d時減少；術后28 d仍然較多；實驗組僅術后7 d骨痂中可見低水平的CGRP陽性表達。分析結果顯示，術后14、21、28 d兩組間CGRP表達量比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。結果見表1。

3 討 論

CGRP可調節生長板軟骨細胞的增生、分化及凋亡，同時，通過對成骨細胞、破骨細胞的數量和活性的調節，使成骨細胞和破骨細胞的活性和數量達到平衡，使骨小梁正常重建，共同完成骨骼的形成和塑形過程；同時，CGRP可間接調節骨的礦物質代謝與平衡，促進基質的礦化。本實驗組織學觀察：對照組術后14 d骨小梁形成增加，成熟度較高，排列成柵欄狀；術后21 d新生骨小梁己相互連續，排列基本規則；術后28 d骨折處新骨連接成片，組織結構基本接近正常組織。室驗組各時間點骨小梁生長稀疏，排列不規則，類骨質較厚，成熟度不高，同時可見骨吸收空腔。進一步證實周圍神經損傷對骺板的正常發育造成了一定的影響，限制了骨骼的縱向生長；同時，實驗組較對照組骨基質礦化質量下降，進一步在組織學方面證實了，骨痂愈合過程中骨形成受到受限并骨質出現疏松。

本實驗研究發現對照組術后14、21 d有大量CGRP免疫陽性神經纖維分布，術后28 d水平仍然較高，而實驗組僅術后7 d有極少CGRP表達，術后7、21、28 d兩組比較均有顯著差異（P＜0.05）。進一步證實，周圍神經損傷后，CGRP分泌進行性減少、消失，對骺板生長發育調控作用消失，影響骨骼生長。這證明了周圍神經組織通過神經肽物質對骨折愈合發揮著重要的調控作用。

表1 CGRP免疫組化染色的平均光密度值比較（xˉ±s）

[1] 楊文彬,韋財.鎖定鋼板內固定治療復雜性脛骨平臺骨折36例的療效分析[J].廣西醫學,2012,34(8):1031-1033.

[2] 楊亞東,周娟,高輝,等.失神經支配在大鼠骨折愈合過程中降鈣素基因相關肽對骨保護破骨細胞分化因子影響的實驗研究[J].中華手外科雜志,2012,28(4):233-237.

[3] 費琴明,陳統一,陳中偉.大鼠脛骨標準骨折模型的制作[J].上海實驗動物科學,2002,22(1):10-12.

[4] 湯池,姜保國,王天兵,等.中樞和周圍神經損傷對降鈣素基因相關肽含量及骨折愈合的影響[J].中華創傷雜志,2008,24(11):888-892.

R683.42；R745

：B

：1671-8194（2014）32-0068-02