黑逍遙散含藥血清對PC12兩種AD模型的LDH、T-SOD、MDA的影響*

吳紅彥， 鄧健男， 李海龍， 楊植媛， 邱家權， 夏 琦

(1.甘肅中醫學院， 甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室、甘肅省中藥新產品創制工程實驗室， 甘肅 蘭州 730000)

老年性癡呆，又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)，是一種病程隱匿、緩慢的神經退行性疾病。現代醫學研究表明，AD的發病機制極為復雜，現AD的發病機制學說已經達到十余種[1-2]。在其眾多的病因學說中，氧化應激學說占據著主導地位[3]。中醫目前多將此病歸于“神呆”范疇。認為其病位在腦，與心、肝、腎功能失調關系密切[4]。發病以內因為主，氣、血、痰、瘀纏結為患。腦髓空虛，氣血不足致心神失養，屬本虛標實之疾[5]。現有的動物實驗研究也印證了從肝脾論治的可行性[6-9]。本次實驗分別參考王亞利[10]、曲喜英[11]等的，建立AD兩種經典的體外模型，運用肝脾腎同治的黑逍遙散(逍遙散+熟地黃)含藥血清干預AD體外模型，以期進一步闡釋黑逍遙散治療AD的機理。

1 材料與儀器

SPF級大鼠40只，雌性，體重(200±20)g，由甘肅中醫學院科研動物實驗中心提供。黑逍遙散各組藥材均由甘肅中醫院藥房提供，LDH、T-SOD、MDA試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，批號：20110928。DMEM培養基由sigma公司提供，批號：20120430。Aβ25-35淀粉肽由上海強耀生物科技有限公司提供，批號：20120405；雙氧水批號：121109。PC-12細胞由上海中科院生物研究所提供。Benchmark plus連續波長酶標儀(上海新振儀器設備有限公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學株式會社，型號：IX71)。

2 方法

3 結果

3.1 不同濃度黑逍遙散含藥血清對兩種造模方法PC12細胞活力的影響 與空白對照組比較，淀粉肽溶液(20μmol/L)模型組細胞存活率顯著降低，差異有顯著意義(P<0.05)；與模型組比較，各個給藥組細胞存活率有顯著提高，差異有顯著意義(P<0.05)。(見表1)

表1 黑逍遙散含藥血清對淀粉肽(20μmol/L)造模各組細胞存活率的影響

與空白對照組比較，H2O2溶液(300μmol/L)模型組細胞存活率顯著降低，差異有顯著意義(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組細胞存活率明顯提高，差異具有顯著意義(P<0.05)。(見表2)

表2 300μmol/L的H2O2溶液造模組測試PC12細胞存活率的影響

3.2 不同濃度的黑逍遙散對兩種造模方法PC12細胞T-SOD、LDH酶活性及MDA含量的影響 與空白對照組比較，淀粉肽溶液(20μmol/L)模型組T-SOD酶、LDH酶活性顯著下降，MDA含量顯著升高，2組差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，各組細胞溶液T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強，MDA含量顯著降低(P<0.05)。當不同濃度的黑逍遙散含藥血清作用于PC12細胞后，與血清組比較，10%濃度含藥血清細胞組T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強，MDA含量顯著降低(P<0.05)。(見表3)

表3 淀粉肽(20μmol·L-1)干預72h后對PC12細胞的酶學指標影響

3.3 與空白對照組比較，H2O2(300μmol/L)模型組T-SOD酶、LDH酶活性顯著下降，MDA含量顯著升高，2組差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，各組細胞溶液T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強，MDA含量顯著降低(P<0.05)。當不同濃度的黑逍遙散含藥血清作用于PC12細胞后，與血清組比較，10%濃度含藥血清細胞組T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強，MDA含量顯著降低(P<0.05)。(見表4)

表4 H2O2(300μmol/L)干預16H對PC12的酶學影響

4 討論

AD有三大病理特征：老年斑、神經元大量丟失、神經纖維纏結。已經有文獻表明[3，12]，氧化應激與AD的三大病理特征都有著密切關系：Aβ淀粉肽主要來自于Aβ肽的碳端蛋氨酸殘基，后者能產生過氧化物并促進氧化反應，還可使可溶性Aβ淀粉肽變成不溶性淀粉肽，導致老年斑的產生；自由基能攻擊不飽和脂肪酸，造成膜結構的損傷，破壞核酸，引起蛋白質表達異常，導致神經元凋亡；自由基還會引起鈣離子超載，導致蛋白磷酸酶與蛋白酶比例失調，從而引起tau蛋白異常磷酸化，進一步形成神經纖維纏結。超氧化物歧化酶(SOD)是機體內清除自由基的重要酶之一，催化自由基的歧化反應，其活性直接反映出機體清除自由基的能力；在細胞受損時，乳酸脫氫酶(LDH)由細胞內流出，其濃度的高低，反映出細胞受損的程度；丙二醛(MDA)是脂質過氧化物的終端產物，可間接反映細胞受損程度，在神經細胞壞死中，AD的發生發展過程中，占有重要位置。

本次實驗結果顯示：與空白對照組比較，Aβ25-35淀粉肽(20μmol/L)與H2O2(300μmol/L)誘導的PC12損傷的模型組細胞存活率均顯著降低，差異具有顯著意義(P<0.05)：與兩組模型組比較，各個給藥組細胞T-SOD、LDH活性顯著升高，MDA含量顯著降低，差異具有顯著意義(P<0.05)。

黑逍遙散方中組成藥物看：當歸、白術、茯苓、甘草有效成分阿魏酸、雙白術內酯、茯苓多糖、異甘草素、甘草總黃酮有不同程度的抗氧化、抗衰老、提高記憶力等作用[13-17]，熟地具有雌性激素樣作用，可能對癡呆有一定影響。史佳琳等[18]發現地黃寡糖預孵育能提高細胞存活率、減少LDH滲漏，從而減輕谷氨酸對神經細胞的損害程度。董榕等[19]發現柴胡注射液則能使噪音組迅速升高的T-SOD、MDA含量接近正常組，能明顯增加小鼠正確反應次數(P<0.01)，結合本次實驗結果黑逍遙散顯示的抗氧化能力，這些也都為黑逍遙散治療AD提供了藥理學基礎。

本次實驗通過兩個比較經典的AD體外模型實驗進一步表明，黑逍遙散均能顯著地提高機體T-SOD，LDH的生物活性，降低MDA含量，這也表明黑逍遙散治療AD的功效可能與提高機體抗氧化能力密切相關。

參考資料：

[1]張均田.神經元-突觸丟失與老年癡呆[J].神經藥理學報，2011，1(1)：1-15.

[2]Lewczuk P，Esselmann H，Bibl M，et al.Tau protein phosphorylated at threonine 18l in CSF as neurochemical biomarker in Alzheimer’s disease：original data and review of the literature[J].Mol Neuresci，2004，23(2)：115-22.

[3]于德紅，魏朝良，包永明，等.阿爾茨海默病與氧化應激[J].生物醫學工程學雜志，2006，23(5)：1142-1144.

[4]李康銘，唐 農.老年性癡呆中醫病因病機研究進展[J].光明中醫，2012，27(9)：1926-1928.

[5]傅喆暾，黃寶康.補腎中藥防治老年癡呆癥研究進展[J].時珍國醫國藥，2003，23(1)：32-34.

[6]瞿禮萍，曾 南，盧陸飛，等.逍遙散對小鼠記憶力的影響[J].中藥藥理與臨床，2008，24(6)：1-3.

[7]吳紅彥，王彩霞.黑逍遙散對AD小鼠學習記憶及抗氧化能力的影響[A].甘肅中醫學院學報，2010，27(1)：9-11.

[8]吳紅彥，王虎平，王彩霞.黑逍遙散對老年性癡呆的防治作用及其機制研究[J].時珍國醫國藥，2011，22(4)：921-913.

[9]吳紅彥，王虎平.從肝脾論治老年性癡呆及逍遙散對老年癡呆模型小學習記憶能力、中樞膽堿能神經元活性的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2010，5(16)：190-192.

[10]王亞利，宋天保，路明，等.Aβ誘導PC-12細胞凋亡建立阿爾茨海默病細胞模型[J].西安醫科大學學報，2002，23(2)：129-132.

[11]曲喜英，祝其鋒.復方丹參注射液對H2O2誘導的PC12細胞凋亡的保護作用[J].中國新藥雜志，2005，14(11)：1284-1288.

[12]卓燁燁，張漢霆，徐江平.氧化應激與阿爾采末病[J].中國藥理學通報，2010，26 (4)：435-437.

[13]金蓓蓓，陳 勤，陳慶林.阿魏酸對擬癡呆小鼠學習記憶和海馬膠質纖維酸性蛋白表達的影響[J].激光生物學報，2011，20(4)：484-489.

[14]馮 星，王正濂，林永成，等.雙白術內酯對Aβ1-40致癡呆模型大鼠的作用[J].中國藥理學通報，2009，25(7)：949-951.

[15]金 惠，趙英博，江 維，等.茯苓藥理作用及臨床應用研究進展[J].湖北中醫雜志，2008，30(4)：59-61.

[16]朱敏娟，楊 靜.異甘草素對丙泊酚致小鼠學習記憶障礙的影響[J].數理醫藥學雜志，2011，24(2)：170-172.

[17]葉懷義，龔賦嵐，尚 明.甘草黃酮抗衰老作用的研究[J].哈爾濱商業大學報，2004，20(1)：93-97.

[18]史佳琳，楊 菁，徐新利，等.地黃寡糖對谷氨酸誘導海馬神經元損傷的影響[J].中國藥理學通報，2009，25(3)：357-361.

[19]董 榕，劉伲娜，昊同智，等.柴胡注射液對噪音所致學習記憶障礙小鼠的改善作用及機制[J].中國行為醫學科學，2007，16(12)：1074-1076.