四川白三葉根瘤菌遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育研究

潘明洪，凌瑤，景文，馬洪平，彭燕＊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川 雅安625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學新農(nóng)村發(fā)展研究院，四川 雅安625014）

生物固氮是指自然界中的一些微生物和藍綠藻將大氣中的不能被植物利用的氮氣還原成可利用的氨的過程［1］。根瘤菌與豆科植物形成的共生固氮體系具有固氮能力強、固氮量高和抗逆性強等優(yōu)點，是生物固氮中效率最高的體系，所固定的氮素約占生物固氮總量的65%［2］。近來有關(guān)的研究日益增多，馬霞等［3］發(fā)現(xiàn)在適宜氮素水平下接種根瘤菌可以明顯增加紫花苜蓿（Medicagosativa）的固氮百分率、生物固氮量和種子產(chǎn)量，李智燕等［4］研究顯示天藍苜蓿根瘤菌比紫花苜蓿根瘤菌具有更強的耐酸、耐鋁性，王衛(wèi)棟等［5］報道接種根瘤菌的紫花苜蓿在NaCl脅迫下具有較強的抗氧化和滲透調(diào)節(jié)能力。因此，了解根瘤菌的生物多樣性，選育高效與抗逆性能優(yōu)良的菌株用于農(nóng)林生產(chǎn)，對于應(yīng)對日趨嚴重的環(huán)境污染和干旱等逆境問題具有深遠的意義。

白三葉（Trifoliumrepens）又名白車軸草、荷蘭翹搖等，是三葉草屬的重要豆科牧草，因其產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性強，在四川地區(qū)分布廣泛，可用作飼料、綠肥、堤岸防護草種、草坪以及蜜源和藥材等［6－7］。目前，國內(nèi)外有關(guān)白三葉根瘤菌遺傳多樣性及系統(tǒng)分類研究的報道頗少。1974年《伯杰氏細菌鑒定手冊》［8］第8版以宿主范圍為依據(jù)，將其確定為三葉草根瘤菌（Rhizobiumtrifolii）。到了1984年，Jordan［9］將三葉草根瘤菌劃分到豌豆根瘤菌（R.leguminosarum），定為豌豆根瘤菌三葉草生物型（R.leguminosarumbv.trifolii）。劉曉云和陳文新［10］、呂飛等［11－12］和劉曉云等［13］在采用16SrDNA基因、nodA和nifH共生基因序列測定方法進行三葉草根瘤菌的分類研究中也得到了相一致的結(jié)果。

16SrDNA因保守性高、信息量大、普遍性及快速簡便的特點而被稱為分子進化種，并被作為系統(tǒng)分類研究中最合適的指標［14］。16SrDNA PCR－RFLP指紋圖譜因具有種的特異性而成為根瘤菌系統(tǒng)分類研究的重要方法［15］。此外，持家基因recA、atpD、glnII、gyrB及thrC等［16］也越來越多地被應(yīng)用于根瘤菌新種群系統(tǒng)發(fā)育地位的確定，可應(yīng)用較為廣泛的細菌分離水平，從種內(nèi)到種間的水平以及更高級別的分析［17－18］。利用不同基因組位點的保守基因來確定細菌的分類地位，將是細菌分類發(fā)展的一個方向［19］。

本研究采用16SrDNA PCR－RFLP及16SrDNA基因、持家基因（recA、atpD、glnII）、結(jié)瘤基因（nodC）和固氮基因（nifH）系統(tǒng)發(fā)育分析方法，對分離自我國四川雅安、康定、瀘定、西昌、成都和樂山6個地區(qū)野生白三葉根瘤的69株菌進行遺傳多樣性的研究，為進一步揭示四川白三葉根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育地位提供可靠的理論依據(jù)，對于豐富根瘤菌資源具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為本實驗室前期分離和保存的白三葉根瘤菌，來源于2011年8－9月在四川6個市縣收集野生白三葉的根瘤。根瘤菌的分離按照Vincent［20］經(jīng)典方法進行，挑取單菌落，經(jīng)過多次純化，革蘭氏染色，鏡檢，斜面保藏［21］。共分離得到供試菌株69株，宿主植物均為白三葉，菌株編號及來源見表1。

表1 菌株來源及16SrDNA PCR－RFLP圖譜類型Table 1 The tested strains and the types of 16SrDNA PCR－RFLP fingerprint patterns

1.1.1 主要試劑和儀器 本研究所使用的PCR試劑及瓊脂糖凝膠電泳試劑購于天根生化科技（北京）有限公司，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，限制性內(nèi)切酶來自NEB（New England Biolabs）公司。主要儀器包括超凈工作臺，生化培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，臺式離心機，PCR擴增儀（Eppendorf，美國），Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.2 供試菌株的培養(yǎng) 供試菌株均用YMA培養(yǎng)基［22］培養(yǎng)，其成分為：甘露醇10.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO40.5g，NaCl 0.1g，酵母粉3.0g，瓊脂18～20g，蒸餾水1000mL，pH 6.8～7.0，培養(yǎng)溫度為28℃。

1.2 根瘤菌DNA的提取

本研究的相關(guān)試驗工作從2013年5月開始在四川農(nóng)業(yè)大學草業(yè)工程實驗室進行。DNA的提取方法參照文獻［23］，以純根瘤菌為材料進行。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA的濃度，所有的DNA樣品于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 16SrDNA PCR擴增與RFLP分析

以總DNA為模板，使用來源于大腸桿菌（Escherichiacoli）16SrDNA序列保守區(qū)域的2個引物P1（5′－CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT－3′）和 P6（5′－CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGAC TTCACCCC－3′），分別對應(yīng)于大腸桿菌的第8～37堿基位置和第1479～1506堿基位置［24］。引物P1和P6配制成10μmol/L濃度備用。PCR反應(yīng)體系為50μL，其中P1和P6各1μL，模板DNA 1μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，Taq DNA polymerase（2.5U/μL）0.5μL，加ddH2O至50μL。PCR擴增條件為：94℃預變性3min；30個循環(huán)（94℃，變性，1min；55℃，退火，1min；72℃，延伸，2min）；72℃，延伸，10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，于－20℃保存。

參照Selenska－Pobell等［25］的方法，用HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和HhaⅠ4種限制性內(nèi)切酶進行酶切。酶切反應(yīng)體系為20μL，其中PCR產(chǎn)物10μL，10×NEB緩沖液2μL，內(nèi)切酶0.5μL，加ddH2O至20μL，過夜酶切，溫度為37℃。以2.0%瓊脂糖凝膠電泳，100V，2h，用自動凝膠成像系統(tǒng)拍照。對酶切電泳圖譜進行分類，電泳圖譜上不同菌株具有相同的電泳條帶被認為是同一個遺傳圖譜類型。

1.4 16SrDNA序列分析

根據(jù)16SrDNA PCR－RFLP遺傳圖譜類型，選取每種圖譜類型組合中的代表菌株，將其16SrDNA PCR擴增產(chǎn)物送往北京六合華大基因科技股份有限公司進行雙向測序，測序引物同擴增引物。將測得的序列經(jīng)拼接后與從GenBank（NCBI）上獲得的根瘤菌相關(guān)種的序列進行比對，經(jīng)Clustal X［26］和Treecon W［27］軟件包分析，用軟件MEGA 5.10按照Neighbor－joining［28］法構(gòu)建出以16SrDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用軟件DNAMAN 6.0計算各測試菌株16SrDNA序列的相似性。

莊大善人聽有“血光之災(zāi)”，額上的汗就冒了出來。他是想到了當漢奸的胞弟莊槐。日本人在中國奸淫燒殺，無惡不作，人人得而誅之。胞弟竟助紂為虐，觸犯眾怒，必然身處險境。風傳新四軍深入敵后除惡鋤奸，莫非胞弟會給莊氏一族招來殺身之禍？

1.5 持家基因（recA、atpD、glnII）與結(jié)瘤基因（nodC）和固氮基因（nifH）的系統(tǒng)發(fā)育分析

持家基因的PCR擴增引物參照文獻［29］。反應(yīng)體系為50μL，其中2×Taq PCR MasterMix 25μL，正向引物和反向引物各1μL，DNA模板1μL，Taq DNA polymerase（2.5U/μL）0.5μL，ddH2O 21.5μL。1）recA擴增條件：95℃，預變性，3min；30個循環(huán)（94℃，變性，1min；54℃，退火，1min；72℃，延伸，1min）；72℃，延伸，6 min。2）atpD擴增條件：95℃，預變性，3min；30個循環(huán)（94℃，變性，1min；58℃，退火，1min；72℃，延伸，1 min）；72℃，延伸，6min。3）glnII擴增條件：95℃，預變性，3min；30個循環(huán)（94℃，變性，1min；55℃，退火，1 min；72℃，延伸，1min）；72℃，延伸，6min。

nodC和nifH基因PCR擴增所用引物見文獻［30］。反應(yīng)體系為50μL，其中2×Taq PCR MasterMix 25 μL，正向引物和反向引物各1μL，DNA模板1μL，Taq DNA polymerase（2.5U/μL）0.5μL，ddH2O 21.5μL。1）nodC基因擴增條件：95℃，預變性，3min；30個循環(huán)（94℃，變性，30s；55℃，退火，40s；72℃，延伸，1min）；72℃，延伸，6min。2）nifH基因擴增條件：95℃，預變性，4min；30個循環(huán)（94℃，變性，30s；57℃，退火，30s；72℃，延伸，1min）；72℃，延伸，5min。

各基因PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，亦送往北京六合華大基因科技股份有限公司測序。用軟件MEGA 5.10分別對測得的代表菌株的基因序列與相應(yīng)的參比菌株序列進行比對，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株16SrDNA PCR擴增結(jié)果

以總DNA為模板，P1和P6為引物，供試菌株的16SrDNA PCR產(chǎn)物均能在1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測出條帶，大小約為1.5kb，這說明供試根瘤菌與其他細菌的16SrDNA片段大小基本一致。

2.2 16SrDNA PCR－RFLP分析

16SrDNA的擴增產(chǎn)物分別采用4種限制性內(nèi)切酶（HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和HhaⅠ）進行酶切，經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后拍照成像。供試菌株的HaeⅢ和MspⅠ酶切分別有4種圖譜類型，HinfⅠ和HhaⅠ酶切分別有3種圖譜類型（圖1）。電泳圖譜上不同菌株間遷移率相同的帶被認為是同一個性狀，隨機標記為A→D。所有69株供試菌株的16SrDNA的酶切圖譜類型總共有4種不同組合類型（表1），其中有Ⅰ類型（AAAA）66株菌，占據(jù)供試菌株的95.7%，其余Ⅱ（BBBB）、Ⅲ（CACA）、Ⅳ（DCDC）3種類型各有1株菌，僅占4.3%。結(jié)果表明，分離自白三葉草的根瘤菌16SrDNA PCR－RFLP圖譜存在較大差異，既有廣泛分布于各取樣地點的Ⅰ類型，同時又有來源于四川康定的Ⅰ和Ⅳ2種類型及四川樂山的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3種類型，所有供試菌株表現(xiàn)出一定的遺傳變異和地域差異。

圖1 供試菌株16SrDNA PCR－RFLP酶切組合圖譜Fig.1 16SrDNA PCR－RFLP fingerprint patterns

2.3 16SrDNA序列分析

根據(jù)16SrDNA PCR－RFLP分析結(jié)果和來源的不同挑選出9株代表菌株進行16SrDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析，并在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對相似序列?？偣策x取12株參比菌株，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。

由圖2可知，9株代表菌株分別歸屬于根瘤菌屬（Rhizobium）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）2個系統(tǒng)分支。圖譜類型為Ⅰ型（AAAA）的XC1110、LD1102、CD1105、KD1104、LS1102、YA1121，Ⅱ型（BBBB）的LS1101，Ⅳ型（DCDC）的KD1107的共8株菌株與根瘤菌屬構(gòu)成一個分支。其中，菌株XC1110和LD1102與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T和R.leguminosarumbv.viciaeUSDA 2370T聚在一起，其相似性為100%。菌株 KD1104、CD1105、KD1107、LS1101、YA1121、LS1102具有相同的序列，與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T和R.leguminosarumbv.viciaeUSDA 2370T序列相似性最高，達到了99.7%。圖譜類型為Ⅲ型（CACA）的菌株LS1105則與土壤桿菌屬單獨形成一支，與A.tumefaciensNCPPB 2437T的親緣關(guān)系最近，相似性達到了99.5%。代表菌株與已知種的模式菌株的序列相似性，均大于目前界定屬內(nèi)16SrDNA序列相似性95%的標準［31］。以上結(jié)果表明，白三葉根瘤菌因存在的地理環(huán)境的不同而表現(xiàn)出一定的差異性，甚至在同一地理環(huán)境下也有較大程度的變異，與16SrDNA PCR－RFLP酶切圖譜類型分類結(jié)果基本一致。

圖2 代表菌株16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16SrDNA sequences of the representative strains

2.4 持家基因序列分析

根據(jù)16SrDNA序列分析和16SrDNA PCR－RFLP，對所選的9株代表菌株進行持家基因（recA、atpD和glnII）部分序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

2.5 nodC和nifH 基因序列分析

所選取的9株代表菌株，除了LS1105外，PCR均能成功擴增出nodC和nifH基因，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4和圖5。

在nodC基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，YA1121、XC1110、LS1102、LS1101具有相同的序列，與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T相似性為97.4%，KD1107、KD1104、CD1105與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T相似性為95.7%，LD1102與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T相似性為95.6%。

在nifH基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株KD1107、KD1104和LD1102與R.leguminosarumbv.trifolii9.2k具有相同的序列，相似性為100%。LS1102、XC1110、LS1101、CD1105和YA1121具有相同的序列，與R.leguminosarumbv.trifoliiR2－1的親緣關(guān)系最近，相似性為97.5%。

圖3 代表菌株持家基因recA、atpD和glnII拼接后的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on concatenated sequences of recA，atpD，and glnII of the representative strains

圖4 代表菌株結(jié)瘤基因nodC構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on nodulation gene nodCof the representative strains

以上結(jié)果表明，除了LS1105以外的8菌株均以R.leguminosarumbv.trifolii親緣關(guān)系最近，可以確定其為三葉草根瘤菌。

3 討論

本研究以分離自我國四川部分地區(qū)野生豆科植物白三葉根瘤的69株菌株為研究對象，充分結(jié)合16SrDNA PCR－RFLP、持家基因（atpD、recA和glnII）及共生基因的系統(tǒng)發(fā)育分析等方法進行了遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究，初步探討了四川地區(qū)白三葉根瘤菌可能的分類地位，對于進一步豐富中國根瘤菌資源的研究具有積極的意義。

圖5 代表菌株固氮基因nifH構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on nitrogen－fixing gene nifHof the representative strains

結(jié)合16SrDNA PCR－RFLP、16SrDNA序列分析結(jié)果，69株供試菌株被鑒定到屬的水平。來自于康定、樂山的菌株具有變異的圖譜類型，而來自雅安、瀘定、西昌和成都的菌株具有單一的圖譜。酶切圖譜類型為Ⅰ型（AAAA）的 KD1104、YA1121、XC1110、CD1105、LD1102、LS1101，Ⅱ型（BBBB）的 LS1101，Ⅳ型（DCDC）的KD1107三種類型的8株菌株歸屬于根瘤菌屬，而Ⅲ型（CACA）的菌株LS1105歸屬于土壤桿菌屬，所有供試菌株共歸為兩個屬，較為單一。這與劉曉云和陳文新［10］分離自三葉草的根瘤菌分別歸屬于快生根瘤菌屬、中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）的研究結(jié)果不太一致，顯示出其屬、種在地區(qū)分布的局限性和專一性，可能與四川盆地特殊的地理環(huán)境和氣候條件有關(guān)。因為劉曉云和陳文新［10］分離的根瘤菌主要來自江西、湖北和云南等地的三葉草屬植物，范圍也相對較廣，從而具有較好的多樣性。本研究與眾多現(xiàn)有的研究一致，根瘤菌與豆科植物的共生關(guān)系因區(qū)域地理環(huán)境的差異而具一定的多樣性［32］，而同一采樣地點的根瘤菌在很大程度上受地域、生態(tài)環(huán)境影響而表現(xiàn)為相似的類群，這與Tian等［33］、楊亞珍等［34］、何恒斌等［35］、閻愛民和陳文新［36］的研究結(jié)果吻合。此外，各個采樣點的菌株雖然在酶切圖譜上有一定差異，但在16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹上則處于相同的位置，與冀玉良等［37］的研究結(jié)果相似。在今后的研究中有待擴大地理范圍和菌株數(shù)量，以更全面地探索白三葉根瘤菌的種屬分布和系統(tǒng)分類。

持家基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果基本一致。除了LD1102與R.leguminosarumbv.viciaeUSDA 2370T外，代表菌株KD1104、CD1105、KD1107、LS1101、YA1121、LS1102、XC1110共7株與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T的親緣關(guān)系最近，LS1105與A.tumefaciensNCPPB 2437T最近。在關(guān)于三葉草根瘤菌的系統(tǒng)分類研究中，Jordan［9］將三葉草根瘤菌定為豌豆根瘤菌的1個生物型R.leguminosarumbv.trifolii。劉曉云和陳文新［10］、呂飛等［11－12］的研究中供試的三葉草根瘤菌，與三葉草根瘤菌R.trifoliiARPV02、豌豆根瘤菌R.leguminosarumUSDA 2370的序列相似性最高，親緣關(guān)系最為接近。本研究中所供試的白三葉根瘤菌與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T和R.leguminosarumbv.viciaeUSDA 2370T的親緣關(guān)系較近，結(jié)果支持Jordan［9］的觀點，即過去的三葉草根瘤菌、豌豆根瘤菌和菜豆根瘤菌3個種合并為1個種，以R.leguminosarum命名。

16SrDNA和持家基因序列分析與16SrDNA PCR－RFLP分析結(jié)果具有一定的差異。其可能的原因為：1）16SrDNA PCR－RFLP廣泛用于大量菌株的快速分群，在數(shù)據(jù)處理過程中可能因人為的判斷而產(chǎn)生誤差。2）同一株菌株中有可能存在16SrDNA基因的不同拷貝，序列有所差異，導致酶切結(jié)果與序列分析結(jié)果不一致。3）16SrDNA序列分析可以鑒定到屬，但基因的橫向轉(zhuǎn)移及重組會影響親緣關(guān)系的遠近［38］。4）16SrDNA核糖體基因的高度保守性，只能鑒定到屬及容易鑒別的種，區(qū)分關(guān)系比較接近的種或菌株存在一定的局限［39］。

此外，本研究從白三葉根瘤中分離得到了土壤桿菌LS1105，此結(jié)果與國內(nèi)外學者在分離根瘤菌的過程中經(jīng)常獲得土壤桿菌的結(jié)果一致［40－41］。Mhamdi等［42］、Wang等［43］分別用gusA和CFP標記土壤桿菌進行了相關(guān)研究，結(jié)果表明，土壤桿菌不具備結(jié)瘤能力，但在根瘤菌的存在下可以進入根瘤中定殖，與根瘤菌共存于根瘤內(nèi)。此外，菌株LS1105擴增不出結(jié)瘤基因nodC和固氮基因nifH，同常佳麗［44］的研究結(jié)果一致，表明其不含共生基因，與其不能單獨侵染豆科植物結(jié)瘤相吻合。

4 結(jié)論

在本研究所分離自野生白三葉根瘤的69株菌株中，16SrDNA PCR－RFLP有4種圖譜類型，表明白三葉根瘤菌在四川具有較為豐富的多樣性，且表現(xiàn)出一定的地域分布特征。16SrDNA基因、持家基因、結(jié)瘤基因、固氮基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，證實了所分離菌株有68株為三葉草根瘤菌，且土壤桿菌不能擴增出結(jié)瘤基因nodC、固氮基因nifH等共生基因。這對于研究白三葉根瘤菌的分類鑒定及遺傳多樣性提供了理論依據(jù)，為豐富四川地區(qū)白三葉根瘤菌資源及篩選能用于生產(chǎn)上的高效優(yōu)良菌株奠定了基礎(chǔ)，具有重大的現(xiàn)實指導意義。

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