低蛋白質日糧補充賴氨酸、蛋氨酸對離乳期梅花鹿氮代謝的影響

黃健，張鐵濤，鮑坤，楊福合，李光玉，王凱英

（中國農業科學院特產研究所 特種經濟動物分子生物學國家重點實驗室，吉林 長春130112）

隨著畜牧業的發展，飼養規模不斷擴大，畜牧業對環境的污染已經成為繼工業污染和生活污染之后又一環境污染的重要源頭。氮排放是畜牧業環境污染的主要問題，特別是尿素和尿囊素的排放，產生了包括NH3和N2O在內的大量有害氣體，這些氣體和CO2成為溫室氣體的主要成分［1－2］，同時大量的氮排放導致土壤氮轉運周期加長，土壤及水體嚴重富營養化［3－4］，要求我們在提高動物生產性能的同時降低氮排放［5］。日糧組成是影響氮排放的重要因素［6－7］，降低日糧粗蛋白質（crude protein，CP）水平是目前減少氮排放，尤其是尿氮排放的最主要方式。有研究表明，降低日糧 CP水平后會降低生產性能［8－10］，但添加蛋氨酸（methionine，Met）和賴氨酸（lysine，Lys）等限制性氨基酸能改善氨基酸平衡，可以維持甚至提高生產性能，提高氮利用率并減少尿氮的排放［5，11］。國內外對梅花鹿低CP氨基酸平衡理論研究甚少，需要在梅花鹿養殖業中研究和探索。本試驗通過低CP日糧中添加Lys和Met對仔鹿營養物質消化代謝、氮平衡及尿嘌呤衍生物（urine purine derivatives，PD）排出量影響的研究，篩選適宜添加水平，為低CP氨基酸平衡日糧技術在梅花鹿上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和試驗設計

選取4只、3月齡健康離乳雄性梅花鹿仔鹿，體重（30±0.12）kg（珚X±SD）。采用4×4完全拉丁方設計，Ⅰ組為高蛋白質對照組，試驗Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組為補充Lys和Met的低蛋白質試驗組。分4個階段進行消化代謝試驗，每個階段14d，預試期為9d，正試期為5d。

1.2 試驗日糧及飼養管理

以玉米、豆粕、玉米纖維、酒糟蛋白、玉米胚芽、苜蓿草粉、糖蜜、食鹽、預混料等按不同比例配制成對照組日糧（CP 16.28%）和試驗基礎日糧（CP 13.40%），試驗基礎日糧添加Lys和Met配制Lys水平相同、Met水平不同的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組試驗日糧。將原料混合均勻后，制成直徑0.4cm，長度1.2～1.5cm的全混合日糧（TMR）顆粒料，配方及營養水平見表1，基礎日糧和試驗日糧中Lys和Met含量見表2。試驗于2013年9月13日－11月7日在中國農業科學院特產研究所茸鹿實驗基地進行，試驗動物在特制代謝籠（長×寬×高分別為2.0m×1.2m×2.0m）中單籠飼養，每日8：00和16：00兩次定量飼喂，自由飲水。

表1 日糧組成及營養水平（風干基礎）Table 1 Composition and nutrient levels of experiment diets（air－dry basis）

1.3 樣品采集與分析測定

1.3.1 糞樣采集與測定 采用全收糞法。連續收集5d，每天稱重并做記錄，準確稱取10%糞樣在65℃烘箱中烘干至恒重，混合均勻，粉碎過0.425mm篩制成樣品。糞樣中的干物質（dry matter，DM）、有機物（organic matter，OM）、粗蛋白質（crude protein，CP）、粗脂肪（ether extract，EE）、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）、鈣（calcium，Ca）、磷（phosphorus，P）含量，參照《飼料分析及飼料質量檢測技術（第2版）》［12］測定，氨基酸（amino acid，AA）采用日立L8900全自動氨基酸分析儀測定。

1.3.2 尿樣采集與測定 采用全收尿法。在桶內加入10%的濃硫酸20mL，保證pH＜3，準確記錄總尿量，每天取總尿量的10%裝于塑料瓶中低溫保存，連續收集5d，以備尿樣CP測定。移取20mL尿樣稀釋至100mL制成次級尿樣，裝入塑料瓶內－20℃貯存，參照IAEA［13］分光光度計法進行PD含量測定。

1.4 統計方法

應用統計軟件SAS 9.1.3的ANOVA進程進行單因素方差分析，用DUNCAN法進行多重比較分析差異顯著性，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

表2 基礎與試驗日糧中Lys和 Met含量（風干基礎）Table 2 Content of Lys and Met in basal diet and test diet（air dry basis） %

2 結果與分析

2.1 低CP日糧添加Lys、Met對仔鹿營養物質表觀消化率的影響

如表3所示，對照組CP消化率極顯著高于Ⅱ組（P＜0.01），顯著高于Ⅲ組和Ⅳ組（P＜0.05），而低蛋白日糧添加Lys、Met提高仔鹿CP消化率趨勢明顯，隨Met添加量增加，Ⅱ組～Ⅳ組CP消化率不斷升高，但差異不顯著（P＞0.05）；處理組EE消化率均高于對照組，其中Ⅱ組極顯著地高于對照組（P＜0.01），其余組間差異不顯著（P＞0.05）；DM、OM、Ca、P、NDF、ADF表觀消化率差異不顯著（P＞0.05），Ⅱ組營養物質消化率均低于對照組（NDF除外），Ⅱ～Ⅳ營養物質消化率隨著Met水平提高而升高，Ⅳ組OM、NDF、ADF、P表觀消化率均優于對照組。

表3 日糧添加Lys、Met對仔鹿營養物質消化代謝的影響Table 3 Effects of supplement Lys and Met in diet on nutrients apparent digestibility of deer %

2.2 低CP日糧添加Lys、Met對仔鹿氨基酸表觀消化率的影響

如表4所示，對照組和Ⅳ組Met消化率顯著高于Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0.05），對照組、Ⅳ組間無顯著差異（P＞0.05）；組間Lys、Cys消化率差異不顯著（P＞0.05）；其余氨基酸消化率對照組均顯著高于各試驗組（P＜0.05）。各試驗組間，與Met代謝相關的蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、胱氨酸4種氨基酸消化率均為Ⅱ組最低，Ⅳ組最高，隨日糧Met水平升高而升高，而酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸消化率隨日糧Met水平升高而降低，其余氨基酸消化率基本一致。

表4 日糧添加Lys、Met對仔鹿氨基酸消化率的影響Table 4 Effects of supplement Lys and Met in diet on amino acid apparent digestibility of deer %

2.3 低CP日糧中添加Lys、Met對仔鹿氮平衡的影響

如表5所示，對照組氮攝入量高于試驗組，并且顯著高于Ⅱ組（P＜0.05），各組糞氮排放量差異不顯著（P＞0.05）；對照組吸收氮顯著高于Ⅱ組、Ⅲ組（P＜0.01）和Ⅳ組（P＜0.05），但對照組尿氮排放量卻顯著大于各試驗組（P＜0.05）；對照組氮沉積略高于試驗組，氮利用率和氮表觀生物學效價低于試驗組（P＞0.05），Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組氮表觀生物學效價分別比對照組高15.50%，15.17%和20.46%；組間氮沉積無顯著差異（P＞0.05）；氮利用率和表觀生物學效價普遍低于各試驗組（P＞0.05），試驗組間參數隨Met增長而升高趨勢明顯。

表5 日糧中添加Lys、Met對仔鹿氮平衡的影響Table 5 Effects of supplement Lys and Met in diet on the nitrogen balance of deer

2.4 低CP日糧中添加Lys、Me對仔鹿尿嘌呤衍生物的影響

如表6所示，對照組PD總排放量顯著大于Ⅱ組（P＜0.01）和Ⅲ組（P＜0.05），與Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）；尿囊素排放量顯著大于Ⅱ組（P＜0.01）、Ⅲ組和Ⅳ組（P＜0.05），黃嘌呤和次黃嘌呤極顯著高于Ⅱ組（P＜0.01）；Ⅲ組、Ⅳ組黃嘌呤和次黃嘌呤極顯著高于Ⅱ組（P＜0.01），其余各項差異均不顯著，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組尿囊素和總PD排放量隨著Met水平的提高而提高。

表6 日糧中添加Lys、Met對仔鹿尿嘌呤衍生物的影響Table 6 Effects of supplement Lys and Met in diet on the purine derivatives of deer g/d

3 討論

適宜蛋白質水平和氨基酸比例能夠發揮營養物質最大消化潛力［14］，營養水平最適時消化率最高，偏離最適營養水平就會降低其消化率，并影響其他營養物質消化利用。于麗偉［15］研究表明日糧CP水平16.50%時仔鹿CP消化率最高，本試驗對照組CP 16.28%與于麗偉試驗水平接近。日糧CP水平降到13.40%日糧可降解蛋白水平相應降低，直接導致瘤胃微生物活性減弱，瘤胃微生物對營養物質消化能力降低，微生物蛋白（MCP，microbial crude protein）合成隨之降低，仔鹿CP消化率顯著降低，Lee等［16］和Russell等［17］同樣表明奶牛、肉牛CP消化率因日糧CP水平降低而顯著降低；DM和OM消化率同樣因日糧CP水平下降而下降，又隨著Met水平升高而升高，與多種營養物質消化率結果一致；NDF、ADF主要在瘤胃中消化，微生物含量是影響其消化率的關鍵因子，試驗組消化率高于對照組可能是因為添加的Lys、Met為游離氨基酸，能被瘤胃微生物直接利用和瘤胃壁吸收，避免降解為氨的過程，從而促進微生物生長，本試驗NDF，ADF消化率有一定降低，但差異不顯著，與Lee等［16］和Russell等［17］研究結果不盡相同，可能是因為Lee等［16］和 Russell等［17］是在自由采食條件下進行的，蛋白質下降導致適口性降低，引起采食量下降，影響了營養物質的消化，而本試驗采用定時、定量法飼喂，采食量基本未受影響。此外氨基酸作為蛋白質的基本結構單位，降低日糧CP水平直接導致氨基酸水平降低，氨基酸缺乏，氨基酸平衡性失當，氨基酸消化率降低［18］，Met作為反芻動物限制性氨基酸，是瘤胃微生物代謝的重要參與物，瘤胃微生物含有很高的Met水平［19］，日糧Met水平很難滿足瘤胃微生物的需要，影響營養物質的瘤胃代謝，日糧添加Met能滿足瘤胃微生物對Met的需求，平衡瘤胃氨基酸比例，提高瘤胃微生物活性［20］，促進瘤胃微生物合成［21］，進而提高營養物質消化率，本研究多種營養物質消化率均隨日糧Met水平增加而增加，Schwab等［22］研究表明，犢牛日糧中添加Met會提高CP消化率，王建紅等［23］通過扣除日糧部分Met研究發現，扣除部分Met會降低犢牛常規營養物質消化率，與本試驗結果一致，云強等［11］研究認為除粗脂肪外其他常規營養物質消化率隨氨基酸添加量有先增加后降低的趨勢，出現不同結果的原因很有可能本試驗添加Met量沒有達到仔鹿最適Met水平，或者還沒有超過仔鹿對Met的耐受能力；同時，本試驗研究表明試驗組日糧中添加Lys與對照組相同后，獲得與對照組相似的Lys消化率，添加Met能顯著提高Met消化率，與張鐵濤等［24］研究結果一致，且氨基酸的相互作用會在體內重分配而保證機體的穩定［25］，Met消化率提高會促進體內以Met為前體的反應產物或中間體（如胱硫醚、谷胱甘肽等）含量增加，胱硫醚在瘤胃中往往需要Met才能合成［26］，是半胱氨酸和絲氨酸的結合物，日糧中Met增加會提高胱硫醚合成酶的活性［27］，需要大量的半胱氨酸、絲氨酸參與反應，提高半胱氨酸、絲氨酸消化率，甘氨酸合成的中間產物和副產物可以接受蛋氨酸分離的甲基碳［28］，也是組成谷胱甘肽的氨基酸之一，日糧Met水平增加能促進谷胱甘肽合成［29］，促進甘氨酸代謝，提高甘氨酸消化率。

在采食量相同時，降低日糧CP水平顯著降低了氮攝入量，且對照組的CP消化率顯著高于試驗組，導致吸收氮顯著高于試驗組，糞氮差異不顯著，但動物組織合成能力有限，氮沉積無明顯差異，多余的氮會從尿液排出，尿氮排放量顯著增加，進而提高了試驗組氮利用率和氮生物學效價，減少了大量的氮排放，有效緩解了環境污染。Varel等［30］研究發現奶牛日糧CP從18.4%降低到15.1%，尿氮排放量從35%降低到23%，本研究將仔鹿日糧CP從16.28%降低到13.4%，尿氮排放量45%降低到38%。董全民等［6］認為，CP為16.1%的日糧中加入一定氨基酸與擁有18.8%CP日糧的奶牛有相同的生產性能，同時減少了氮損失，但并不影響尿氮或糞氮的排泄，與本研究結果相同。本實驗沒有添加非蛋白氮，蛋白氮是食入氮的唯一來源，被瘤胃微生物利用而合成微生物蛋白（MCP），在小腸中降解后被動物吸收，并在體內代謝最終轉化為尿嘌呤衍生物（PD），研究認為反芻動物尿中PD主要是由MCP轉化而來，只有極少部分轉換為體內組織，剩余部分隨尿液排出體外［31］，其含量與MCP產量呈高度正相關，能直接反映MCP的產量［32］，PD也是尿中的主要含氮物質之一，對照組尿囊素和總PD顯著高于試驗組也是尿氮變化的間接表現。本試驗表明仔鹿日糧添加Met能促進尿囊素和總PD排放量增加，間接表明日糧補充Met可促進瘤胃MCP產量的增加，White等［33］研究發現日糧添加Met能促進總PD和尿囊素排放，提高MCP的合成，燕磊［21］研究同樣表明日糧添加Met能增加瘤胃微生物對氨氮的利用率，MCP的合成增加、細菌氮濃度相應增加、氨氮的濃度降低，與本試驗結果一致。同時，本試驗發現添加Met能促進仔鹿氮沉積、氮利用率及氮生物學效價，與王建紅等［23］、Abe等［34］認為在日糧中添加 Met會促進犢牛增重和提高氮沉積，Oke等［35］報道綿羊的氮沉積與日糧Met水平呈正相關結果是相同的。但Schwab等［22］報道，斷奶犢牛皺胃灌注L－Met的理想劑量約為0.06%，當添加到0.12%時，氮沉積開始下降，而本實驗添加到0.12%時仍繼續增加，出現不同結果的原因可能是Schwab等［22］使用的是L－Met，利用率高于本試驗中的DL－Met，并且飼喂氨基酸會被瘤胃微生物部分降解，其利用率亦有可能低于直接灌注晶體氨基酸的利用效率。可見適當降低仔鹿日糧蛋白水平，添加Lys、Met對營養物質消化利用、降低氮排放量是有益的，仔鹿Met需要量有待進一步研究。

4 結論

（1）仔鹿日糧CP水平從16.28%降低至13.40%會降低氮沉積，補充Lys、Met后氮沉積和氮利用率升高，氮排放減少、降低環境污染；（2）仔鹿日糧CP水平從16.28%降低至13.40%會造成CP、氨基酸消化率下降，補充Lys、Met能有效改善氮平衡，提高多種營養物質消化率，促進MCP合成；（3）仔鹿日糧CP水平從16.28%降低至13.40%補充0.23%Lys和0.12%Met是可行的。

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