熱休克蛋白27心肌特異性高表達誘導小鼠產生心肌肥厚

老年人心臟病患者常伴有心肌肥厚的病理改變,臨床和基礎研究已證實心肌肥厚是老年人心臟衰竭和致死性心律失常發生的獨立危險因子。隨著年齡增加,心肌肥厚進展而引起心肌舒縮障礙,最終導致心衰[1]。因此研究心肌肥厚發生發展的分子機制,通過干預其關鍵分子靶點而抑制心衰發生,已成為心血管領域眾多學者們關注的焦點。

熱休克蛋白27(Hsp27)又名HspB1,是小熱休克蛋白家族的重要成員,其在心肌和骨骼肌等組織細胞中的表達尤為豐富[2]。本課題組在前期構建好的中度表達Hsp27的轉基因(TG)小鼠模型發現,心肌特異性表達Hsp27抑制異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚,深入研究發現該TG小鼠心肌特異性表達Hsp27還具有降低阿霉素誘導的心肌凋亡[3-4]。然而,Xu等[5]研究發現,過表達的β-腎上腺受體TG小鼠引起的心肌病和心衰模型中,心肌組織內Hsp27蛋白的表達水平明顯升高并出現了氧化應激現象。本文旨在探討Hsp27高表達的TG小鼠中,心肌及心功能變化情況，以及Hsp27高表達對TG小鼠存活率的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本課題組與南京大學模式動物中心合作,通過心肌特異性表達啟動子α-MHC啟動,人為構建不同Hsp27表達量的TG小鼠,并飼養于該動物中心SPF級動物房。本研究中以10只8周齡的Hsp27高表達TG雌鼠為實驗組,平均體質量為(23.12±3.19) g,10只周齡和性別匹配的野生型(WT)小鼠為對照組,平均體質量為(22.15±2.24) g。所有實驗遵循南京大學動物倫理委員會要求和實驗動物管理規定。

1.2 方法

1.2.1 心功能測定:鼠腹腔注射三溴乙醇(200 mg/kg)麻醉后剃毛,暴露胸部,由心超室醫師進行超聲檢查(vivo770心臟系統,Visualsonics,探頭頻率13MHz)，保存M超聲圖片。再通過測量至少5個連續心動周期的參數平均值得到心功能參數。

1.2.2 蛋白印記:取出冷凍保存心臟組織,冰上加入600 μl裂解液,電動勻漿器以13 000 r/min勻漿。4 ℃,10 000 r/min,離心20min后提取總蛋白。將總蛋白置于120 ml/L SDS-PAGE凝膠進行電泳,電泳結束后將蛋白轉移到PVDF膜(milipore 公司)上(100 V,60 min);5%脫脂牛奶封閉1 h后,分別以Hsp27(1∶25 000)(Cell Signaling Technology 公司)、GADPH(1∶5000)(Cell Signaling Technology 公司)4 ℃搖床過夜;次日用TBST洗膜后,將PVDF膜與辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG (H+L)(Vector 公司)(1∶20 000)置于4 ℃搖床下孵育2 h;免疫印跡以ECL(Pierce公司)顯影、曝光。

1.2.3 實時定量PCR:從小鼠心室提取總RNA,然后mRNA逆轉錄成cDNA。配總體積20.5 μl反應體系:Mix Syber-green 12.5 μl,引物4 μl,ddH2O 3 μl,cDNA 1 μl。放入Roche PCR分析儀器里,反應條件為:95 ℃預變性10 min,然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,共40循環,72 ℃ 5 min。反應結束后,置于4 ℃冰箱,備電泳。ANP和BNP可作為判斷心功能不全的指標,是心肌肥厚標記物[6]。實驗中所用的引物如下:

ANP:上游引物:5-TGAGCCGAGACAGCAAACATC-3;下游引物:5-AGGCCAGGAAAGGAAGAAGC-3。

BNP:上游引物:5-GGGCTGTGACGGGCTGAGGTT-3;下游引物:5-AGTTTGTGCTGGAAGATAAGA-3。GAPDH:上游引物:5-ACGCAACAGGGTGGTGGAC-3;下游引物:5-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3。

2 結果

2.1 TG鼠中的Hsp27心肌表達鑒定 為檢驗不同TG系小鼠心肌組織內Hsp27蛋白的表達水平,本課題組提取了小鼠的心臟組織蛋白,通過Western blot技術檢測不同品系的Hsp27蛋白表達。如圖1所示,不同TG系的心肌Hsp27蛋白表達水平高低不等: TG85與TG94相比,Hsp27蛋白表達水平明顯升高(P<0.01),TG10和TG21與TG85的Hsp27蛋白表達水平相比又進一步升高(P<0.01)。Hsp27表達量最高的品系為TG10 和TG21,表達量中等的品系為TG85,而表達量較低的品系為TG94。

注:TG85與TG94比較,**P<0.01;TG21和TG10與TG85比較,△△P<0.01圖1 不同品系TG小鼠Hsp27表達水平的比較

2.2 高表達Hsp27的TG10鼠產生心肌肥厚 本課題組從小鼠心臟大體形態、質量及心肌肥厚標記物水平3個方面觀察不同表達量的Hsp27對小鼠心臟的作用,結果顯示Hsp27高表達會誘導小鼠產生心肌肥厚。如圖2所示,與WT相比,Hsp27高表達的TG10組心臟體積明顯增大(圖2A)。TG10的心臟質量(mg)/體質量(mg)HW/BW、心臟質量(mg)/脛骨長(mm)HW/TL比值明顯高于WT(P<0.01; 圖2B)。TG10鼠與WT鼠相比,心肌肥厚標志物ANP、BNP的mRNA水平也明顯升高(P<0.01; 圖2C)。

2.3 高表達Hsp27的TG10鼠表現心功能不全 如表1中所示, TG10小鼠的左心室容積和左心室質量對于WT小鼠都有顯著增加(P<0.01或P<0.05)。代表心臟收縮功能射血分數(EF)、短軸縮短率(FS)和心臟舒張功能的早/晚舒張比率(E/A)在TG小鼠中都有著明顯下降(P<0.01或P<0.05),提示TG10小鼠出現心功能不全。

圖2 WT和高表達Hsp27的TG10小鼠心功能情況

項目WTTG10EF(%)(n=10)64.23±4.6748.40±8.01??FS(%)(n=10)34.15±3.2024.12±4.69??LVIDd(mm,n=10)3.29±0.473.77±0.38?LVIDs(mm,n=10)2.17±0.362.87±0.43??LVVd(ml,n=10)45.10±15.3161.87±14.60??LVVs(ml,n=10)16.37±6.5532.61±11.25??左室質量(mg,n=10)75.39±13.7792.87±15.12?左室質量Corrected(mg,n=10)60.32±11.0174.30±12.10?二尖瓣E/A(n=6)1.68±0.191.32±0.24?

注:LVIDd:舒張期左室內徑; LVIDs:收縮期左室內徑; LVVd:舒張期末期左室容積; LVVs:收縮期末期左室容積;與WT組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.4 高表達Hsp27的TG10鼠死亡率升高 如圖3所示,43周齡的TG10鼠便出現了死亡。85周齡WT存活率為100%,而TG10存活率僅為63.64%。TG10與WT相比,88周齡存活率明顯降低(P<0.01)。

注：與WT組比較，**P<0.01圖3 WT高表達Hsp27的TG10小鼠生存曲線圖

3 討論

本研究結果發現,Hsp27在TG10小鼠心肌肥厚的發生、發展中起著重要的作用,TG10小鼠心肌特異性高表達Hsp27誘導產生心肌肥厚和心功能不全,最終導致TG10小鼠壽命縮短。提示Hsp27可以作為心肌病患者,如結蛋白心肌病,潛在治療靶點。

Hsp是一種應激蛋白[7],Hsp家族按分子量分為以下幾個亞族:Hsp10,小分子Hsp(sHsp),Hsp40,Hsp60,Hsp70,Hsp90和Hsp110[8]。Hsp27是小分子sHsp家族中重要的成員之一,具有抵抗熱休克、氧化應激、炎癥、凋亡等作用,是應激情況下維持內環境穩態的重要作用因子[9-11]。本課題組前期研究已經表明,心肌特異性適度表達Hsp27通過抗氧化作用,改善阿霉素誘導的心功能不全和內毒素導致的心肌損傷[5,12]。Peart等[13]發現,Hsp27還參與了衰老過程中阿片類物質介導心肌保護。然后Arrigo等[9]發現,在小鼠成纖維細胞中Hsp27的高表達顯著降低胞內活性氧(ROS)的基礎水平并上調總谷胱甘肽水平。Rajasekaran等[14]發現,R120G aB-crystal TG小鼠中還原應激導致蛋白質的聚集增多,從而誘導產生結蛋白心肌病。有趣的是,在存在還原應激的心肌病模型中發現心肌中Hsp27的水平顯著增加[14]。在本研究中,發現相似的現象。因此,本課題組推測心肌中高表達Hsp27的TG10小鼠可能是通過還原應激從而引起心肌肥厚。

心肌肥厚的本質是蛋白質的合成和降解平衡紊亂:在各種不同的外界刺激作用下心肌蛋白質的合成異常增多,而清除蛋白質聚集的代謝途徑受到抑制,導致心肌細胞體積增大和肌纖維增粗、增多,從而使心肌舒縮障礙,最終導致心力衰竭[15]。大量研究發現,心肌肥厚的發生發展與Hsp27、還原應激有關,但此病理過程中確切分子機制還未被清晰闡明。

本課題組下一步將通過對心肌組織進行氧化產物檢測,以明確Hsp27高表達是否會引起還原應激,進而確定其具體分子機制,這對心肌肥厚、心肌老化的預防及治療,緩解心臟由代償階段向失代償階段轉變有重大意義,為不可逆性心力衰竭的發展提供一個新的治療靶點。

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