曲格列酮抑制宮頸癌SiHa細胞增殖中的作用

宮頸癌發病率居婦科惡性腫瘤之首,中晚期患者死亡率較高[1],尋找高效低毒的藥物具有重要的臨床意義。研究證實,多種人類腫瘤包括宮頸癌均高表達過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ, PPARγ)[2]。PPAR激動劑噻唑烷二酮類化合物曲格列酮(Troglitazone, TGZ)除用于治療糖尿病外,還具有潛在的抗腫瘤作用,且其不良反應相對較小[3]。p27是一種廣譜細胞周期蛋白激酶CDK的抑制劑,其表達異常導致多種腫瘤的異常增殖[4]。p27基因很少發生突變,其表達調控主要發生在蛋白降解水平,S期激酶相關蛋白2(skp2)可通過促進對蛋白的泛素化降解,從而在多種腫瘤增殖中發揮重要的作用[5]。研究表明在多種腫瘤中,skp2表達的異常增高與腫瘤惡性程度及預后有關。在肝細胞癌等腫瘤中發現[6],曲格列酮可通過調控p27表達,抑制腫瘤細胞的增殖和細胞周期進程。

本研究以宮頸癌SiHa細胞株為研究對象,觀察曲格列酮對體外培養的宮頸癌SiHa細胞生物學行為的影響,并對其分子機制進行初步探討,觀察skp2、p27在曲格列酮抗宮頸癌細胞增殖過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 曲格列酮終濃度溶于二甲亞砜(DMSO),-20 ℃保存。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司生產),四甲基偶氮唑藍(MTT)液(BIOSHARP公司),pcDNA3.1-Myc 載體質粒、pcDNA3.1-Myc-skp2表達質粒由南京凱基生物科技發展有限公司合成,p21、p27、cyclinE1及skp2蛋白抗體購自santa cruz公司。倒置顯微鏡(Olympus公司,日本),SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州凈化),酶標儀(BIO-RAD公司),流式細胞儀(FACS Calibur Becton-Dickinson)。

1.2 細胞培養及分組 宮頸癌SiHa細胞株(由南京醫科大學藥理研究室惠贈)置于含10%胎牛血清高糖型DMEM培養基(含10 U/L青霉素和100 mg鏈霉素,Hyclone公司)中,于37 ℃,5% CO2飽和濕度培養箱中培養,2～3 d換液1次。細胞分為空白對照組、曲格列酮藥物實驗組(100、200、400 μg/ml)。

1.3 細胞增殖檢測 細胞接種于96孔細胞培養板(5×103個細胞/孔),檢測24、48、72 h時細胞增殖情況。每孔加入MTT(5 mg/ml),培養4 h后各孔加入DMSO孵育30 min,微量振蕩器振蕩10 min使結晶物充分溶解,酶標儀在490 nm波長下檢測每孔的吸光度(OD)值,設3個復孔,細胞生長抑制率(%)=(陰性組OD值-實驗組OD值)/陰性組OD值×100%。

1.4 細胞周期測定 SiHa細胞(2×105個/ml)接種于6 cm培養皿培養12 h,換DMEM 培養液(0.5% FBS)培養24 h以周期同步化。曲格列酮(400 mg/ml)作用24、48、72 h后,收集細胞制備單細胞懸液,70% 冷乙醇固定,4 ℃過夜,PBS洗去固定液,加 RNaseA 20 μl、37 ℃ 孵育30 min,加碘化丙啶(propidium iodide,PI)染液冰浴30 min,300目篩網過濾后調整細胞密度為1×105/ml,上流式細胞儀檢測。

1.5 細胞凋亡率檢測 采用Annexin V-FITC染色法檢測細胞凋亡,細胞接種于24孔細胞培養板(1×105個細胞/孔),分別檢測24、48、72 h時細胞凋亡率。0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集細胞,PBS洗滌2次后離心(2000 r/min,5 min)，收集并懸浮細胞至流式管,加入5 μl Annexin V-FITC混勻,再加入PI 5 μl混勻;室溫、避光反應15 min，流式細胞儀檢測(Ex=488 nm;Em=530 nm)。

1.6 質粒轉染 按Lipofectamin2000說明書進行,細胞接種于24孔板,貼壁后繼續培養至50%～80%密度時進行轉染實驗;質粒DNA、脂質體分別加入無血清培養基中,再將兩者混勻室溫孵育30 min,加入培養皿各孔細胞中,轉染后24 h更換完全培養基繼續培養。

1.7 Western blot檢測p21、skp2、p27蛋白的表達 細胞棄培養液,預冷PBS洗3次,RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞內蛋白,BCA法進行蛋白質定量,用8%SDS-PAGE凝膠進行電泳分離,轉PVDF膜。封閉液室溫封閉1 h,按適當比例加入一抗,4 ℃孵育過夜,TBST 洗3次,按1∶3000的稀釋倍數加入辣根酶標記的二抗,室溫孵育1 h,TBST 洗3次,用ECL顯色并曝光于X膠片,Image J軟件的圖像分析儀分析。

2 結果

2.1 曲格列酮對SiHa細胞增殖的影響

2.1.1 曲格列酮抑制宮頸癌SiHa細胞增殖:與對照組相比,SiHa細胞加入曲格列酮24 h后,藥物組可見細胞增殖受到抑制,其中200 μg/ml和400 μg/ml組的生長抑制作用明顯增強(P<0.05);藥物作用48、72 h時,曲格列酮各組均可見到細胞抑制率明顯增加(P<0.05),提示曲格列酮抑制SiHa細胞增殖,隨著藥物濃度及作用時間的增加,其生長抑制作用明顯增強,呈時間和濃度依賴性。見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05圖1 不同濃度曲格列酮藥物對宮頸癌SiHa細胞增殖抑制作用

2.1.2 流式細胞術分析曲格列酮對宮頸癌SiHa細胞周期的影響:曲格列酮(400 mg/ml)作用于宮頸癌SiHa細胞0、24、48、72 h時,處于G0/G1期的檢測細胞數分別為48.58%、52.96 %、54.83%、69.02%,而G2期和S期的細胞數目則相應減少。見圖2。

2.2 曲格列酮對SiHa細胞凋亡的影響 曲格列酮(0、100、200、400 μg/ml)作用于宮頸癌SiHa細胞后,流式細胞儀檢測顯示24 h總凋亡率分別為2.7%、3.8%、3.7%、6.7%,48 h后凋亡率為3.0%、5.7%、4.3%、5.5%,72 h后凋亡率為4.4%、5.9%、6.1%、7.0%,各時間點及劑量點之間比較,未見顯著差異(P>0.05)。

圖2 曲格列酮對人宮頸癌SiHa細胞周期的影響

2.3 曲格列酮抑制SiHa細胞增殖的機制研究

2.3.1 曲格列酮對p21、p27表達的影響:PPARγ及其配體可通過細胞周期依賴性激酶抑制素(CKI)抑制細胞增殖。因而,本研究對400 mg/ml濃度曲格列酮作用于SiHa細胞0、24、48、72 h后p21、p27的表達水平進行檢測,結果發現,p21在SiHa細胞中表達較弱,并且隨作用時間延長,其表達呈現微弱增強;而400 mg/ml濃度曲格列酮作用24 h后p27蛋白表達即出現顯著增高,隨時間延長表達水平逐漸增高。曲格列酮對p27、skp2蛋白表達的影響:前面實驗檢測曲格列酮作用于SiHa細胞后,p27表達顯著增高,skp2參與p27蛋白表達調控,因而,進一步檢測 p27、skp2在曲格列酮(400 mg/ml)作用后的表達變化,結果發現濃度為400 mg/ml曲格列酮作用于SiHa細胞0、24、48、72 h后,p27與skp2的表達呈現明顯相反趨勢。見圖3。

圖3 曲格列酮對p21、p27、skp2蛋白表達的影響(GAPDH為內參)

2.3.2 skp2過表達對曲格列酮提高p27表達水平及抑制細胞周期進程的影響：由于曲格列酮作用于SiHa細胞后p27、skp2表達呈明顯相反趨勢，為了驗證p27、skp2蛋白在曲格列酮調節細胞周期中的作用，構建pcDNA3.1、pcDNA3.1-skp2表達質粒并轉染SiHa細胞。skp2表達質粒轉染后，p27明顯下調。曲格列酮(400 mg/ml)作用于轉染pcDNA3.1細胞后，p27表達水平隨時間延長逐漸升高，skp2表達呈相反趨勢；而作用于轉染pcDNA3.1-skp2表達質粒的細胞后，前面p27蛋白表達上調現象消失。見圖4，5。

圖4 skp2表達質粒轉染SiHa細胞后p27、skp2表達(GAPDH為內參)

注:圖A為pcDNA3.1-Myc空質粒轉染;圖B為pcDNA3.1-skp2表達質粒圖5 pcDNA3.1-Myc空質粒轉染及pcDNA3.1-skp2表達質粒(GAPDH為內參)

為進一步驗證曲格列酮對轉染skp2細胞周期的影響,流式細胞儀實驗結果顯示,曲格列酮(400 mg/ml)作用于skp2表達質粒轉染后的SiHa細胞0、24、48 h后,G1/S期比例為49.4%,52.15%和52.96%,細胞周期的抑制作用明顯減弱。

3 討論

PPAR是一類由配體激活的核轉錄因子亞型,屬于Ⅱ型核受體超家族,其生物學功能復雜,參與調節脂類、糖代謝、炎癥反應、腫瘤細胞分化及凋亡等過程,其中PPARγ及其激動劑目前研究最為廣泛。噻唑烷二酮類化合物曲格列酮,是一種人工合成的PPARγ激動劑,最初作為胰島素增敏劑用于糖尿病研究,后來發現其不僅可以調節糖脂代謝作用,還具有抗動脈粥樣硬化、抑制炎癥反應、抑制血糖效應等生物學活性[7-8]。近年來研究證明,PPARγ 激動劑對多種腫瘤細胞具有誘導抑制分化及抗腫瘤作用[9]。

3.1 曲格列酮抑制宮頸癌細胞生長增殖 本研究顯示,曲格列酮對宮頸癌細胞生長具有明顯抑制作用,且呈時間和劑量依賴性。在胃癌的研究中[10],曲格列酮均顯示了良好的抗腫瘤增殖作用,與本研究結果一致。惡性腫瘤生物學行為包括失控性增殖生長及遠處轉移,無限增殖能力與細胞周期失調及抗凋亡有關。我們用不同濃度曲格列酮作用于宮頸癌細胞,細胞未見明顯核皺縮、邊聚的細胞凋亡形態特征。我們對細胞周期進行檢測,結果發現:400 mg/L曲格列酮作用后,宮頸癌細胞G0/G1期細胞比例顯著增高,S期及G2期比例明顯下降, 并呈現明顯的時間依賴性,提示曲格列酮作用后,細胞可能發生G1/S期阻滯進而抑制細胞增殖。

3.2 曲格列酮通過調節細胞周期而非凋亡途徑抗宮頸癌增殖的機制 本研究首次發現,曲格列酮通過調節細胞周期而非凋亡途徑對宮頸癌SiHa腫瘤細胞具有抗增殖作用。與本研究結果不同,近期Chen等[11]在宮頸癌Hela細胞的研究顯示,曲格列酮的抗腫瘤效應與凋亡途徑有關,并與p53泛素化密切相關,TGZ-PPAR-γ-p53信號通路在TGZ促調亡中發揮了關鍵性作用。由于不同宮頸癌細胞系之間存在組織病理學、基因表達的差異,Hela細胞為p53基因突變型,而SiHa細胞為p53基因野生型,p53基因在細胞周期調節及凋亡過程中均發揮重要作用,其基因型差異會造成生物學行為不同,未來可擴大研究以進一步明確或發現與之相關的基因表達變化及信號通路。總之,研究提示曲格列酮在不同腫瘤細胞中具有抗腫瘤增殖作用,其作用途徑可能存在差異。

既往研究表明人宮頸癌組織存在p27表達下調現象,并與宮頸癌的預后呈明顯相關性,而p27作為細胞周期重要抑制素,其主要在G1/S轉換期發揮作用,因此,我們用不同濃度曲格列酮作用于宮頸癌細胞,并檢測p27蛋白的表達。結果顯示曲格列酮顯著提高細胞p27的表達水平,并呈明顯的劑量依賴性。由于在腫瘤細胞中,p27 mRNA水平相對恒定,p27蛋白水平調節主要發生在蛋白質降解水平[12]。p27蛋白活性及降解與該蛋白的磷酸化、泛素化降解有關。skp2是p27泛素化降解的重要因素,在多種腫瘤中,存在skp2表達上調,從而下調p27水平實現細胞的增殖[13]。因此,我們又進一步檢測了skp2、p27表達相關性,結果顯示曲格列酮作用于細胞后skp2、p27水平呈現相反趨勢,曲格列酮顯著提高細胞p27表達水平,提示曲格列酮可能通過skp2調節 p27的表達。宮頸癌SiHa細胞分別轉染空質粒和skp2表達質粒后, Western blot檢測發現,skp2過表達后,曲格列酮提高細胞p27蛋白表達作用被明顯抵消,提示曲格列酮可能主要通過抑制skp2表達從而提高p27的表達水平。進一步研究發現,skp2過表達后,曲格列酮對細胞周期進程抑制作用消失。以上研究說明,曲格列酮可能是通過下調skp2,進而上調G1/S期重要的細胞周期素p27的表達,產生對SiHa細胞的G1/S周期的阻滯作用。

本研究結果發現,曲格列酮體外具有明顯抑制宮頸癌SiHa細胞增殖作用,其機制可能通過抑制skp2表達,從而提高細胞p27蛋白水平實現。

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