紫花苜蓿QTL與全基因組選擇研究進展及其應用

康俊梅，張鐵軍，王夢穎，張怡，楊青川

（中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193）

＊紫花苜蓿（Medicagosativa）是世界上分布最廣，種植面積最大的飼草作物品種。由于其適應性強、產草量高、營養價值豐富，且具有生物固氮等優良特點，已在世界范圍內被廣泛種植，種植面積達32×106hm2［1］。在美國，苜蓿已被作為第三大作物，僅次于玉米（Zeamays）、大豆（Glycinemax），種植面積大約800萬hm2［2］。在我國，近幾年苜蓿種植面積不斷增加，大約為300萬hm2，居世界第6位，而且種植面積還有不斷擴大的勢頭。紫花苜蓿是同源四倍體，異花授粉植物，由于其自交衰退的特點，使其遺傳改良與二倍體作物相比更為復雜。盡管國內外苜蓿育成品種取得較大的發展，但這些品種的選育方法都是通過傳統的育種手段。傳統的育種方法選育周期長，一般需要5～7年，而且需要消耗大量的人力、物力，進行大面積的田間表型選擇。隨著現代分子標記技術的快速發展，分子標記輔助育種技術開始興起，并不斷成為分子育種中最重要的育種技術之一［3－4］。該技術是利用分子遺傳標記，借助于目標基因緊密連鎖的遺傳標記的基因型分析，鑒定分離群體中含有目標基因的個體，從而提高了選擇效率，減少了選擇的盲目性，可極大提高傳統育種的選擇效率，加速育種進程［5－6］。特別是對抗性基因的篩選，可以脫離傳統育種情況下所必需的選育環境。因此，開展苜蓿遺傳圖譜構建與QTL定位研究，對加速苜蓿遺傳改良與新品種選育具有重要的意義。本文綜述了苜蓿遺傳圖譜構建與特征，QTL定位及發展趨勢，并對關聯作圖與全基因組選擇等方面的研究進展加以概括。以便讀者對本領域有較全面的了解，并為分子標記輔助育種技術在苜蓿遺傳改良中的應用提供理論依據。

1 分子標記的發展及其應用

最早應用分子標記的是Botstein等［5］利用限制性內切酶片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）構建了人類遺傳連鎖圖譜，從而奠定了分子標記技術研究的基礎，此后分子標記技術發展迅速，先后有隨機擴增多態性DNA（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）、簡單重復序列間擴增（inter－simple sequence repeat，ISSR）和單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）等，這些技術在種質資源遺傳多樣性與系統發育分析、品種指紋圖譜繪制、遺傳純度檢測、遺傳連鎖圖譜構建及基因標記定位與克隆等方面被廣泛應用［7］。分子標記應用于二倍體苜蓿遺傳圖譜的構建及相關研究較早，也比較成熟，最早的二倍體苜蓿遺傳圖譜是以紫花苜蓿W2xiso和藍花苜蓿PI440501雜交獲得的F2群體為材料，用130個RFLP標記構建了包含10個連鎖群，覆蓋圖距467.5cM的遺傳圖譜［4］。之后通過檢測苜蓿屬多年生和一年生苜蓿的SSR標記，又補充了9個SSR標記使該圖譜的遺傳距離達到646.5cM［8］。利用紫花苜蓿變種和藍花苜蓿雜交的F2重組群體也構建了遺傳圖譜，該圖譜具有包括RFLP、RAPD、同功酶標記和表型標記共計89個分子標記［4，8］。此外，采用RFLP、RAPD繪制了二倍體栽培苜蓿F1群體和1個回交群體的遺傳圖譜，并用16個公共標記整合成1張包括130個標記、8個連鎖群的圖譜［9］。此后，以黃花苜蓿、藍花苜蓿、二倍體紫花苜蓿和截形苜蓿等不同材料為親本，對其雜交后的F1和F2群體構建了較為飽和的二倍體苜蓿遺傳圖譜［10－13］，但不足之處是這些遺傳連鎖圖譜利用的是不同的二倍體群體和不同的標記，因此不能完全融為一體。

四倍體紫花苜蓿由于具有四倍體遺傳特性和自交不親和特點，使其與二倍體苜蓿相比進行分離群體的分析更困難［10－13］，其遺傳圖譜構建進程相對緩慢。目前，只有為數不多的幾個完整的四倍體苜蓿遺傳圖譜的報告。最早的報道是利用四倍體苜蓿F1群體，分析32個RAPD標記的分離結果，發現了9個連鎖群，分別屬于4個連鎖組，并且研究了構建四倍體苜蓿遺傳圖譜的策略［13］。四倍體苜蓿的連鎖圖譜構建的困難主要在于對3種雜合基因型位點劑量的鑒定。有的分子標記如SSR和RFLP等不能區分四倍體雜合體基因位點單劑量、雙劑量或三劑量幾種類型，即在技術上鑒別AAAa，AAaa和Aaaa是不可能的。目前四倍體苜蓿遺傳圖譜的建立存在2種途徑，一種是基于Brouwer和 Osborn［14］提出的利用單劑量位點（single dose alleles，SDAs）檢測和估計分子標記間的連鎖距離。SDAs在配子體中的分離情況為1∶1（有∶無），這與簡單的二倍體基因型中的一個顯性等位基因類似。利用一代回交群體，一套基于SDA的四倍體苜蓿遺傳圖譜在2005年完成［15］，包含了所有8條染色體組。另一途徑是利用專門用于建立同源四倍體物種遺傳圖譜的軟件TetraploidMap［16］，采用F1群體，同時利用單劑量和雙劑量的分子標記作圖。通過這一途徑已成功地建立了一套四倍體苜蓿遺傳圖譜［17］。

然而，大多數分子標記，如：SSR、AFLP等是不能夠滿足基因的精細定位和全基因組關聯研究［18］。SNP是最新發展的第三代分子標記技術，是目前最具發展潛力的分子標記，因其在基因組中數量多、分布廣，且具有遺傳穩定性高、等位基因性，在基因分析過程中不需要根據片段大小將DNA分帶，可實現大規模自動化，適合于數量龐大的檢測分析。隨著高通量檢測技術（基因芯片、genotyping－by－sequencing）的發展，高通量SNP基因分型技術已經成為全基因組關聯分析與特異基因精確定位的重要手段。在高密度遺傳圖譜構建、性狀作圖和基因的精確定位、群體遺傳結構分析以及系統發育分析等方面具有廣闊的應用前景［18－19］。目前，在美國開始采用SNP技術對四倍體苜蓿和二倍體苜蓿群體構建高密度的遺傳連鎖圖譜，初步獲得了一些與產量、秋眠性、抗寒性及水分利用效率性狀相關的 QTL位點［20－23］。

2 苜蓿遺傳連鎖圖譜的構建與特點

目前，已有許多二倍體苜蓿和四倍體苜蓿的遺傳圖譜被構建成功。盡管早期的幾個圖譜對連鎖群體的定名有隨機性，但大部分圖譜的連鎖群與蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）所對應的染色體緊密聯系。連鎖群的長度范圍為234～794cM，并且許多圖譜具有嚴重的偏分離標記［15，24－28］。有趣的是，用F2代群體構建的連鎖圖譜中多數偏分離標記是有利的雜合子［14］，這表明有利于對有活力基因的超顯性與偽超顯性合子的選擇。盡管二倍體圖譜簡單，但是四倍體苜蓿品種構建的圖譜將為苜蓿育種提供更多的信息，具有重要的使用價值。苜蓿由于具有四倍體遺傳特性，因此它的4個同源染色體在減數分裂是均可與其他幾個染色體配對。這種雙價體配對的優勢限制了雙倍型降低的發生［26］。四倍體遺傳特性比二倍體更為復雜——4個等位基因可以出現在1個給定的個體并且任何1個等位基因的劑量范圍從0到4都有可能。這些復雜的情況是四倍體苜蓿遺傳圖譜構建的挑戰，尤其是等位基因的劑量不確定的時候。遺傳作圖軟件“TetraploidMap”［18］能夠把顯性和共顯性標記結合，實現四倍體苜蓿的連鎖圖譜構建［28－31］。

許多與產量［26，30－31］、抗寒性［32－33］、持久性［34］、耐鋁性［35］和水分利用效率［36］等表型性狀相關的 QTL 已經在四倍體苜蓿連鎖圖譜上進行了定位。但是也存在一些潛在的因素限制了四倍體苜蓿圖譜的精確性和有效性。首先，分子標記數量有限，遺傳連鎖圖譜的飽和度差，而且構建的連鎖圖譜是由4個同源染色體組成，這4個同源染色體的飽和度不能確定［26］，Markers在4條染色體分布不均勻，影響了四倍體苜蓿遺傳圖譜的準確性。其二，遺傳作圖群體數量小，也是影響遺傳圖譜和QTL定位準確性的重要因素。四倍體苜蓿群體遺傳作圖不同于二倍體苜蓿，在四倍體苜蓿群體中每個同源染色體重組的幾率只有50%，而且每對同源染色體配對的機會占群體單株數的16.7%［37－38］。迄今為止，所有的作圖群體不超過200個單株，很可能導致對QTL數量低估而對其作用效率高估。此外，如果QTL在父母本中存在多態性，那么在這個群體中檢測QTL的能力就偏低。目前還沒有開發出合適的計算機程序用于區間作圖的合成，分析QTL之間的互作以及評估基因與環境之間的互作。因此，某種程度上，這一理論還不能完全應用于同源四倍體苜蓿的育種方案。

最新發展的高通量SNP基因分型技術將是構建高密度遺傳連鎖圖譜與重要農藝性狀基因在染色體上精確定位的重要手段。美國最近在這些方面取得了很大的進展，通過454測序技術，在2個抗旱和非抗旱基因型間發現了近4萬SNPs，同時發展了高分辨溶解曲線（high resolution melting，HRM）的基因分型高通量平臺，可以對四倍體苜蓿進行精準的SNP劑量鑒定［18］。美國遺傳育種學家Brummer實驗室已經完成了對23個四倍體與4個二倍體苜蓿轉錄組的測序，包括從美國的苜蓿育種公司得到的經典苜蓿基因型。從中發現了25000個Unigene以及900000個SNPs。這項研究鑒定的SNPs在豆科信息庫中已經被公布［39］。該項研究的重大進展為四倍體苜蓿高密度遺傳圖譜的構建及重要農藝性狀的QTL定位奠定了重要的基礎。最近，他們在發現的900000個SNPs中選取了10000個來自關鍵性狀候選基因的SNP，并合成了Illumina iSelect高通量基因芯片，對現存的2個苜蓿群體進行了SNP基因分型。這些新添加的SNP分子標記將大大提高基因圖譜的分子標記密度，幫助對已知QTL的精準定位，并且可以鑒定新的QTL位點。

3 苜蓿重要性狀QTL定位及其應用與發展趨勢

QTL圖譜是鑒定控制數量性狀基因的一種常用方法，對于探索自然遺傳的變異發揮著重要的作用。在二倍體和四倍體苜蓿中已經建立了一些基因連鎖圖譜。應用QTL作圖，一些重要的農藝性狀，如產量［30－31］、耐寒性［32－33］和耐鋁［35］等QTLs已經鑒定出來。然而，由于有限的基因圖譜分辨率，大多數的QTL定位在很大的區間間隔內。隨著大量SNP標記和高效的高通量基因分型手段的開發，與重要農藝性狀相關的基因已經在玉米和水稻（Oryzasativa）中成功的精細定位。由于紫花苜蓿中分子標記的數量較少，重要性狀基因的定位有一定的局限性。

目前，在苜蓿中定位的主要QTL位于較大的染色體區段，如果這些QTL要在育種中得到應用必須縮小定位區間并加以驗證。盡管在同源四倍體精細作圖QTL定位的研究還非常少，但是具有代表性的非接瘤表型性狀的遺傳位點nn1已經完成了精細定位［40－41］。這個位點的基因已經在四倍體苜蓿中被克隆［41－42］。這個位點的精確定位是首先用一個四倍體苜蓿F2群體的800個單株在一個候選區域作圖，然后用二倍體苜蓿連鎖圖譜確定這個區域所用的分子標記，然后對2000多個單株的F2群體進行精細作圖。最后，應用二倍體苜蓿成熟的遺傳圖譜，并通過比較作圖來進一步完成QTL的定位。

已有大量實驗證實在蒺藜苜蓿中鑒定的基因或QTL，對苜蓿的遺傳改良具有一定的應用價值。如，苜蓿抗炭疽病的一個主效基因（RCT1）在蒺藜苜蓿中被克隆［43］，苜蓿抗春季黑莖病和葉斑病的QTL也在蒺藜苜蓿的遺傳圖譜中被確定［44］，但是它們的抗性沒有得到證實。此外，與氮素營養［45－46］、開花時間以及形態特征［47－48］相關的QTL也被鑒定。近幾年，通過基因組測序發現苜蓿近緣種蒺藜苜蓿與四倍體苜蓿有高度的共線性關系［49］，因此，蒺藜苜蓿遺傳圖譜構建與QTL定位研究為四倍體苜蓿的相關研究奠定了良好的基礎［40－51］。

近年來，隨著分子標記及高通量基因分型技術的發展，美國已經在27個苜蓿基因型中通過轉錄組測序挖掘出了25000個表達序列標簽（expressed sequence tags，EST）序列和90萬個SNP位點［39］。這些EST序列和SNP位點為構建遺傳圖譜、候選基因定位和準確定位等提供遺傳和基因組資源。10KIllumina的苜蓿SNP芯片已經成功地開發，為苜蓿研究者和育種工作者提供了高通量基因分型平臺［39］。最近，美國塞繆爾羅伯特諾貝爾基金會正在利用基因芯片，對現存的苜蓿群體進行SNP基因分型，添加大量新的SNP分子標記到原來的低密度遺傳圖譜中去。部分QTL也已被定位于遺傳圖譜上。新的SNP分子標記將提高已知QTL的精準定位和鑒定新的QTL位點。Brummer博士研究組已經獲得了苜蓿的基因分型序列，并成功地開發了四倍體苜蓿GBS數據分析通路［52］。這些基因組資源和先進的基因分型技術將會促進在高通量QTL作圖、全基因組關聯分析（genome wide association studies，GWAS）、全基因組選擇（genome selection，GS），候選基因關聯分析和精細作圖中QTL 的挖掘和驗證［52－53］。

4 關聯作圖研究現狀

關聯作圖（association mapping）的方法也可以對重要性狀進行QTL定位，所用的作圖群體可以是收集的地方品種或育種用的品系［54－55］。關聯作圖群體與家族型作圖群體相比在某一特定性狀上將有更多的多態性QTL位點并在多個性狀上產生變異。因此，為遺傳作圖提供更廣闊的推理空間。此外，在育種群體中，關聯作圖可以直接提供標記信息從而立即加速遺傳增量。與家族型QTL作圖類似，關聯作圖也依賴于一個標記和目標基因（或QTL）之間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）。由于重組的結果，與家族型QTL定位分析相比，關聯作圖也能精確定位QTL，但由于連鎖不平衡發生在基因組中更短的距離內，所以需要分子標記的密度更大才能對 QTL定位［56］。

連鎖不平衡的程度取決于群體的遺傳史。在1個普通的具有多樣性的二倍體群體中，木質素生物合成途徑中4個基因的連鎖不平衡迅速衰減到1kb以內［57］。在1個具有遺傳多樣性的四倍體苜蓿種質資源中調控開花的基因（CONSTANS－LIKE）中也發現了連鎖不平衡的快速衰減的現象［58］。LD快速衰減的現象可能是由于苜蓿雜交的特性以及苜蓿種質資源收集中保持有效的群體數量。紫花苜蓿育種群體來源于父母種質其相對遺傳范圍狹窄，使LD足夠廣泛避免了關聯作圖中所需的成百上千標記。盡管SSR分子標記的高突變率可能導致對LD的高估，但仍可以合理評估區間為1Mbp左右的四倍體苜蓿育種群體廣義連鎖不平衡［57］。為了便于苜蓿關聯作圖分析，目前已出版了用于評估同源四倍體不同分子標記之間連鎖不平衡的計算機軟件程序［23］，可以針對不同群體進行LD模式的評估。

5 全基因組選擇研究現狀及發展趨勢

基因組選擇（genomic selection，GS）是于2002年被首次提出，是利用覆蓋全基因組的高密度分子標記進行輔助選擇的一種方式，所有的QTL都至少與一個分子標記存在連鎖不平衡，甚至可以追溯到大量影響不同數量性狀的基因，從而實現對數量性狀進行更準確的評定，在很大程度上實現了標記輔助選擇的優勢［59］。基因組選擇得以實現歸功于基因組序列中發現了大量的單核苷酸多態性（SNP），并且新的技術手段可以有效地對這些大量的SNP進行基因分型。模擬研究與育種試驗結果表明，遺傳標記可以高度精確地預測育種值，但是對于群體樣本與分子標記評估效應存在差異時要求有更多的試驗進行專門的驗證。然而，通過基因組數據評估育種值的理想方法是計算已知基因型的個體在每個QTL位點育種值的條件均值。開展基因組選擇研究的重要組成部分是通過QTL效應的貢獻率計算條件均值。在實際育種中，通過分子標記基因型評估育種值的方法都很相似，但是，越來越多的序列和SNP數據的獲得將成為評估育種值的最理想方法。基因組選擇研究計劃的實施將對遺傳評價體系和遺傳改良技術產生深遠的影響，該項新型育種技術正使全球動植物遺傳改良發生重大變革［59－62］。因此，全基因組選擇將成為全球最受關注的研究熱點，在未來的育種實踐中會有廣闊的應用前景。

基因組選擇的最基本思路：在基因組中存在大量遺傳標記（SNP），影響性狀的所有基因都至少與1個標記緊密連鎖，通過對所有標記效應的估計，實現對全基因組所有基因效應的估計，利用估計的標記效應計算個體育種值，即基因組育種值（genomic estimated breeding value，GEBV），然后根據 GEBV的大小（或結合系譜、后裔信息）進行選擇。在全基因組選擇中，要計算群體中每個單株的基因組育種值（GEBV），每個育種值的計算是基于1個模型，該模型包括影響每個性狀的所有標記。選擇是建立在基因組育種值的基礎上，而不是依靠表型性狀的信息。實際上，全基因組選擇的價值在于表型性狀僅僅是用來建立和改進育種模型，而基因組育種值則是通過DNA和標記的評估來進行預測。正像在傳統的表型選擇中，建立育種參數的同時，對多個性狀進行選擇。模擬研究表明，與表型選擇和分子標記輔助選擇相比較，全基因組選擇對多個QTL控制的復雜性狀在單位時間內能夠獲得更大的遺傳增益，這取決于全基因組選擇預測模型的準確性，模型的準確性取決于性狀遺傳力，群體大小，連鎖不平衡的廣度和標記的數量［60－63］。

為了建立一個全基因選擇模型必須進行表型性狀和分子標記數據的收集，實際上是在進行一個平行的表型選擇育種方案。一旦模型建立好，通過模型中確定的全基因育種值可以對每個個體進行評估和選擇。值得注意的是表型選擇的評價將會不斷在表型選擇育種方案中進行，但是表型評價不僅在被選擇的植物資源中具有重要的作用，而且也將為進一步改進全基因組選擇模型提供補充的信息［59－60］。GS選擇是通過對盡可能多的后代群體單株進行基因分型后基于基因育種值評估的基礎上進行。模型的更新對GS很有必要，不僅為分子育種值提供補充的數據，而且在選擇中可以重新評估每個標記隨著等位基因變化的權重。隨著測序技術的快速發展，基因分型成本的大大降低，基因組選擇比表型性狀選擇不論在時間和成本效益上均具有更強的優勢［61－64］。

目前，已有報道GS成功地應用于牛的育種中，而在植物育種中相關的報道還鮮為少見［60－61］。對紫花苜蓿而言，應用GS需要預測模型能夠解釋其四倍體和高度雜合的特性，這無疑與二倍體苜蓿相比選擇過程變得更為復雜。因此，在四倍體苜蓿中評價等位基因的劑量比簡單地確定特定等位基因的存在或缺失就顯得更重要［52－53］。此外，許多標記需要估算其成本效益，要獲得大批量分子標記位點的數據最經濟有效的方法是通過測序進行基因分型（GBS）［65－66］。但是，四倍體不同于二倍體和自交品種，GBS應用于雜合性高的同源四倍體苜蓿將面臨2個限制因素：首先，在同源四倍體中，某個個體特定位點缺失數據的補充難度很大幾乎無法實現，而在自交二倍體中，缺失數據的補充通過緊密連鎖標記的基因型就可以完成［52，66］。第二，需要深度測序獲得每個位點的劑量信息。然而，這種方法可能比其他方法需要更高的成本，但隨著測序成本的降低，這種方法將在近幾年會成為新的發展趨勢。

6 討論及展望

隨著分子標記手段的不斷更新和基因組圖譜的日趨飽和，其應用也隨之向深度和廣度推進［53］。目前，已將分子標記輔助選擇育種技術與傳統育種方法相結合成功應用于動植物育種中，極大地促進了動植物育種的選育進程。然而，最新發展的全基因組選擇與分子標記輔助選擇相比，更具有無可比擬的優勢［59］。

分子標記輔助選擇僅能對部分遺傳變異進行檢測，而且容易將其遺傳效應值估計過高。此外，分子標記輔助選擇關注的是對少數幾個數量性狀位點進行定位，預期通過精確定位這些QTLs確定主效基因的位點。全基因組選擇方法則能夠方便地對所有遺傳變異和遺傳效應進行準確檢測和估計。其研究目的不是鑒定功能突變，而是應用隨機的一組全基因組的標記來預測育種值。由于這種方法跟蹤所有的遺傳變異，希望對候選個體在不需要表型評價鑒定的基礎上可以精確的獲得育種值［60－61］。在短期內，全基因組選擇使育種值的計算變得更為復雜化，尤其是通過國家育種評價系統來計算。但是，從長遠目標來看，育種值和遺傳值的評估模型完全依賴于基因分型個體的DNA標記，而不受研究個體的干擾。因此，當前全基因組選擇受到高度的重視，但值得注意的是需要更多的驗證，才能得到廣泛的應用［59］。

全基因組選擇對加快育種進程更勝一籌。經過第一代表現型鑒定并建立基因型和表現型的關系后，隨后全基因組選擇可以在溫室通過反季節加代的方法來進行，一年可以完成3個輪回的選擇，有效地縮短育種進程，降低育種成本。分子標記輔助選擇技術很難同時對多個數量性狀進行有效選擇，且因不同性狀的標記往往不同，增加了檢測成本［60－63］。此外，全基因組選擇可以在基礎群體中對多個數量性狀進行表型檢測并且對各個標記的效應進行估計，在育種群體中利用相同的SNP標記對所有性狀進行分析。尤其是基因芯片技術和高通量基因分型檢測與分析等新型技術的出現不僅為基因的定位、表達研究提供了新的工具，而且大大降低了分子標記應用的費用。相信在不久的將來，通過模式植物水稻、擬南芥（Arabidopsisthaliana），尤其是豆科模式植物蒺藜苜蓿的基因組計劃和相關研究的影響下，全基因組選擇方法在苜蓿上的應用研究必將迎來一個迅速發展的時代［62－66］。

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