刺激隱核蟲感染對褐菖的脅迫及魚體的免疫應答

尹 飛龔頎楊施兆鴻孫 鵬彭士明高權新但學明李安興

(1. 中國水產科學研究院東海水產研究所, 農業部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室, 上海 200090; 2. 中山大學生命科學學院, 水產品安全教育部重點實驗室/生物防治國家重點實驗室, 廣州 510275; 3. 華南農業大學動物科學學院, 廣州 510642)

尹 飛1龔頎楊2施兆鴻1孫 鵬1彭士明1高權新1但學明3李安興2

(1. 中國水產科學研究院東海水產研究所, 農業部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室, 上海 200090; 2. 中山大學生命科學學院, 水產品安全教育部重點實驗室/生物防治國家重點實驗室, 廣州 510275; 3. 華南農業大學動物科學學院, 廣州 510642)

為探明刺激隱核蟲感染對褐菖生理機能的影響, 研究分別用2500、5000、7500和10000幼蟲/魚的刺激隱核蟲感染褐菖, 并分別檢測感染后24h、48h、72h 和96h各時間點血清中皮質醇(COR)、血糖(GLU)、總蛋白(TP)含量; 肝臟中丙二醛(MDA)和維生素 C(VC)含量, 超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活力; 鰓和皮膚中溶菌酶(LZM)活力。結果顯示, 隨著感染濃度的增加, 血液中COR和GLU含量均出現不同程度的升高, 其中2500、 5000和7500幼蟲/魚組COR含量的最高值均出現在感染后第3天; 而TP含量總體呈現逐步下降的趨勢, 尤其當感染濃度達到5000幼蟲/魚后, TP含量的下降程度明顯增加; 肝臟中MDA含量呈先降后升的變化趨勢, 其中24h、48h和72h 各點MDA含量的最大值均出現在10000幼蟲/魚組, 最小值則集中出現于在2500和5000幼蟲/魚組; 而VC含量則與MDA含量的趨勢相反; SOD和CAT活力均出現不同程度的升高; 鰓和皮膚 LZM活力總體呈先上升后回落的變化趨勢。綜上可知, 刺激隱核蟲感染會對魚體造成氧化脅迫和脂質過氧化反應, 其嚴重程度與感染的蟲細胞濃度相關。低濃度感染組的魚所受脅迫較輕, 在滋養體脫落后仍具有一定的自我修復能力; 而高濃度感染組魚免疫因子的釋放受到抑制或出現紊亂,即便在蟲體脫落后, 其體質也很難恢復。

刺激隱核蟲; 褐菖; 皮質醇; 抗氧化酶; 溶菌酶

1 材料與方法

1.1 刺激隱核蟲

實驗所用的刺激隱核蟲蟲株為中山大學病害實驗室建立的刺激隱核蟲GD1株。該蟲株源自自然感染的卵形鯧[(500±50) g], 并繼續以卵形鯧作為動物模型, 建立起GD1株傳代系統。在傳代第5次時,收集足量幼蟲用于實驗。

1.2 實驗魚

1.3 實驗方法

參照Dan, et al.[15]的方法, 在18:00—21:00, 收集脫包囊孵化 1h 內的活躍幼蟲于潔凈燒杯中。隨機吸取已知體積且均勻的蟲液數滴, 分別滴于載玻片上。用甲醛殺死幼蟲后于顯微鏡下計數, 并計算出蟲液濃度。分別按Ⅰ︰2500幼蟲/魚 、Ⅱ ︰5000幼蟲/魚 、Ⅲ ︰7500幼蟲/魚 和Ⅳ ︰10000幼蟲/魚的濃度感染4組實驗魚, 另外以未感染組 (0幼蟲/魚) 作為對照, 每組設3個平行。感染在容積為252 L 的水族缸中進行, 每尾魚用水5 L, 每缸含水共計100 L。在黑暗條件下, 將所需數量的蟲液倒入實驗缸中, 感染2h 后放入干凈海水正常飼養。在整個實驗過程中,水質理化條件與暫養期間相同。

1.4 樣品采集和檢測

分別于24h、48h、72h和96h從各濃度感染組和對照組取樣。每次從各水族缸中隨機取出3尾, 用0.15 mL/L丁香油將試驗魚麻醉后, 用1 mL無菌注射器尾靜脈采血, 置于無菌離心管中, 室溫靜置1h后, 于4℃靜置過夜, 3500 r/min 離心10min, 取上層血清置于?20℃冰箱保存備用。隨后將魚置于冰盤上解剖, 取出肝臟、鰓和皮膚后, 用預冷生理鹽水快速沖洗, 并用吸水紙小心吸干。測定前先在冰盤內將樣品剪碎, 向各組樣品中分別加入9倍體積(w/v)預冷勻漿介質(試劑盒), 將勻漿液置于TGL-16G型冷凍離心機(3500 r/min、4℃)離心10min。根據需要, 將上清液稀釋后進行酶活力及總蛋白測定。

血清COR的測定采用酶聯免疫法, 試劑盒為美國R&D公司的海水魚皮質醇ELISA試劑盒。血清GLU和TP含量用邁瑞MINDRAY-BS200全自動生化分析儀測定。MDA和VC分別按照說明書在532 nm波長下測定。

酶活力測定均采用試劑盒 (南京建成) 檢測,相應操作參照說明書進行。其中, SOD 活力按黃嘌呤氧化酶法, 活力單位定義為1 mg組織蛋白在1 mL反應液中SOD 抑制率達50%時所對應的SOD量為1個SOD活力單位 (U)。CAT活力采用比色法, 活力單位定義為每分鐘分解1 μmol的過氧化氫即為1個酶活力單位 (U)。血清中LZM活力通過濁度比色法測定。反應底物為用磷酸緩沖溶液 (0.05 mol/L pH 6.1) 配制的0.2 mg/mL微壁溶球菌 (Micrococcus lysoleikticus) 懸液。100 μL血清與1900 μL菌懸液混合, 在530 nm波長下, 分別在0.5min和4.5min測定吸光值(OD)。活力單位定義為LZM每分鐘使含菌酶液吸光值減少0.001所需的能力即為1個酶活力單位(U)。

各組織總TP測定按照考馬斯亮藍法[16], 以牛血清白蛋白 (BSA) 作為標準, 采用試劑盒 (南京建成) 進行。

1.5 數據分析與統計方法

試驗數據以一元方差分析 (One-way analysis of variance, ANOVA) 和Duncan法進行多重比較。以上統計分析在SPSS 11.5環境下進行。數據結果為平均值±標準差 (mean±SD)。P＜0.05為差異顯著。采用Sigmaplot作圖。

2 結果

圖1 刺激隱核蟲感染對褐菖血清生化指標的影響Fig. 1 Serum biochemical parameters of Sebastiscus marmoratus to the acute Cryptocaryon irritans infection

多重比較表明, 隨著感染濃度的增加, 肝臟中MDA含量呈先降后升的變化趨勢 (P＜0.05)。其中24h、48h和72h 各點MDA含量的最大值均出現在10000幼蟲/魚組(P＜0.05), 且96h時的最大值也出現在相對高的感染濃度組 (7500幼蟲/魚)(P＜0.05)。而24h、48h和96h各點MDA含量的最小值則出現在5000幼蟲/魚組 (P＜0.05); 72h時則出現在2500幼蟲/魚組 (P＜0.05)。而VC含量則隨著感染濃度的增加呈先升后降的變化趨勢 (P＜0.05)。其中, 7500幼蟲/魚組在第96h和10000幼蟲/魚三個時間點的VC含量均顯著低于其他各組的各個時間點的所測得的結果 (P＜0.05)。

與對照組相比, 各感染組的SOD活力均出現不同程度的升高 (P＜0.05)。其中, 隨著感染濃度的增加, 除5000幼蟲/魚(P＞0.05) 和7500幼蟲/魚(P＜0.05)兩組SOD活力在第96h出現小幅回落外, 其余各組各時間點 SOD活力均隨著感染后時間的推移表現出升高的趨勢。除對照和 2500幼蟲/魚組各時間點間CAT活力差異不顯著外 (P＞0.05), 其余三組CAT活力隨著感染后時間的推移總體呈升高的趨勢(P＜0.05)。與對照組相比, 5000幼蟲/魚和7500幼蟲/魚兩組的CAT活力在第72h之后出現顯著升高 (P＜0.05), 而10000幼蟲/魚則從第24h開始其CAT活力就顯著高于對照組 (P＜0.05)。

圖2 刺激隱核蟲感染對褐菖肝臟脂質過氧化和抗氧化力的影響Fig. 2 Lipid peroxidation and antioxidant activities of Sebastiscus marmoratus to the acute Cryptocaryon irritans infection

3 討論

COR是魚體中一種與應激有關的重要激素。在受到脅迫時, 血液中COR濃度升高, 這往往會導致機體免疫力下降, 長此以往, 會引起生長變緩。寄生蟲感染會對魚體造成脅迫[17]。Bowers, et al.的研究顯示, 大西洋鮭 (Salmo salar L.) 感染了鮭瘡痂魚虱 (Lepeophtheirus salmonis) 后, 血清 COR含量顯著升高[10]。在本研究中, 褐菖血清中COR含量隨著感染濃度的升高而上升。其中2500幼蟲/魚、5000幼蟲/魚和7500幼蟲/魚3個感染組褐菖血清COR含量的最高值均出現在感染后3d, 而此時也正是滋養體發育成熟, 魚體表“白點”最明顯的時候。此時患病嚴重的魚攝食量逐步減弱乃至停止, 呼吸速度加快, 并出現不同程度死亡[13]。上述結果說明, 感染后3d魚體的應激反應最為強烈。因此建議在實際生產中, 此時應盡量減少對魚的干擾, 否則會增加魚體應激。2500幼蟲/魚和5000幼蟲/魚組魚在感染后4d,即蟲體大量脫落后, 血清COR含量出現顯著回落。這說明相對低感染濃度組的魚所受脅迫較輕, 仍具有一定的自我調節力。而高濃度感染組的魚, 即便在蟲體脫落后, 體質也很難恢復, 隨后相繼死亡。

圖3 刺激隱核蟲感染對褐菖鰓(A)和皮膚(B)溶菌酶活性的影響Fig. 3 Branchial (A) and cutaneous (B) LZM activity of Sebastiscus marmoratus to the acute Cryptocaryon irritans infection

此外, GLU和電解質也被認為是應對脅迫的響應因子[18]。在急性脅迫情況下, GLU濃度往往隨著COR和腎上腺素含量的升高而上升。如在寄生蟲感染中, 在鮭瘡痂魚虱感染大西洋鮭第21天時, GLU和COR含量均顯著升高[10]。這是因為COR可以促進肝內糖原異生, 增加糖原儲存, 促使GLU升高。在本研究中, 各感染組褐菖GLU含量均顯著高于對照組, 且與COR含量的升高情況相似。另外, 5000幼蟲/魚和7500幼蟲/魚組血清Na+、Cl–離子濃度和Na+/K+-ATP酶活力隨著感染時間的增加, 在96h內出現先升后降的趨勢; 而10000幼蟲/魚組的上述指標, 在感染48h后均顯著升高, 并維持在較高水平[13]。這說明魚體嚴重感染刺激隱核蟲時, 鰓部的泌氯細胞遭到破壞, 這極大的干擾了離子的排出, 并造成血清滲透壓失衡[19]。研究認為, 脅迫嚴重時應激激素 (COR和兒茶酚胺) 可以起到調控ATP酶活性的作用, 并以此來彌補由于泌氯細胞受損而減弱的離子泵功能。除此之外, 血清蛋白含量和血細胞容積也被認為是評價組織損傷的指標。在魚體感染瘡痂魚虱后, 隨著Cl–離子濃度的升高, 血清蛋白含量和血細胞容積則顯著降低[17], 這與本研究中蛋白含量的變化情況相似。因此也進一步說明患“白點病”的褐菖魚體滲透調節出現了異常。

MDA 是機體脂質過氧化反應的終產物之一,對其含量的測定可以間接反應細胞的損傷[20]。在寄生蟲感染中, MDA也被當作評價組織受寄生蟲傷害程度的生物學指標。Gismondi, et al.的研究顯示, 當鉤蝦 (Gammarus roeseli) 感染了棘頭蟲(Polymorphus minutes) 后, 降低的MDA含量說明機體具備了較強的自我保護力, 其細胞所受的損傷也有所減輕[21]。在本研究中, 2500幼蟲/魚和5000幼蟲/魚感染組魚肝臟中MDA含量與對照組相比顯著降低。這可能由于寄生蟲為了能依附宿主生存, 通過抑制脂質的過氧化或消除脂質過氧化物進而對宿主進行了一定程度的保護。而高濃度刺激隱核蟲感染組, 魚體肝臟MDA含量卻隨感染時間的延長而顯著升高。這說明寄生蟲感染后, 機體中脂質過氧化反應明顯加強[22]。但要想詳細了解肝細胞在刺激隱核蟲寄生后的損傷程度, 還需要最直接的組織病理學觀察結果來說明。

SOD和CAT是清除活性氧自由基的重要酶蛋白,對機體細胞損傷后的氧化過程和吞噬作用具有很強的防御功能。通常認為, SOD在清除活性氧的過程中最早發揮作用, 它首先促使O2–歧化為H2O2和O2, 隨后CAT再將H2O2催化為H2O和O2, 從而達到為機體解毒的目的。Morga, et al.的研究顯示, 包拉米蟲(Bonamia ostreae) 感染歐洲牡蠣 (Ostrea edulis) 后,血細胞中SOD基因過表達, 起到了抑制活性氧分子(ROS)過量產生的作用[23,24]。在本研究中, SOD、CAT含量隨著感染濃度的升高, 分別于感染后(1—3)d開始不斷升高。這說明刺激隱核蟲感染致使褐菖肝臟中的自由基大量積累, 而SOD和CAT活力升高則有望降低肝臟所受到的傷害。此外, 有研究顯示雖然扁彎口吸蟲 (Clinostomum detruncatum) 感染克林雷士鯰魚 (Rhamdia quelen) 后, 肌肉中SOD和CAT活性與對照組相比未發生顯著改變。但通過檢測“叔丁基過氧化氫引發的化合光”的升高情況, 該作者認為鯰魚肌肉中非酶系統的抗氧化防御力有所減弱[25]。并據此推測, 上述情況導致了機體的氧化脅迫和隨之而來的肌肉脂質過氧化損傷[25]。在本研究中, 非酶系中的VC含量在高濃度感染組顯著降低的現象也進一步證明, 褐菖肝臟受到了嚴重氧化脅迫和脂質過氧化反應的不利影響。

LZM是白細胞中的一類先天免疫防御成分, 它通過水解細胞壁中的肽聚糖來殺滅細菌。研究顯示, LZM在抗寄生蟲的免疫防御中發揮作用[26]。Dan, et al.研究認為, 用刺激隱核蟲滋養體細胞制備疫苗,并通過腹腔注射給點帶石斑魚后, 血液中LZM活力顯著升高, 并在第4周達到最大值[11]。此外, 在理化和生物因子異常引起的急性脅迫情況下, LZM活性也可以作為魚類應激程度的指示信號[27]。Zhou, et al.研究顯示, 當水體中懸浮物過多時, 半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis) 肝臟中LZM活力在5d內顯著升高[28]。Hua, et al.研究了嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后的史氏鱘(Aclpenser Schrenckii)血清及各組織中LZM活力的變化, 結果顯示血清、肝臟和黏液中LZM活力與對照組相比出現不同程度升高; 而腸道、胃和鰓等組織中LZM活力低于或僅僅接近于對照組[29]。在本研究中, 鰓和皮膚是刺激隱核蟲寄生的部位, 也是受到直接損害最嚴重的組織。刺激隱核蟲寄生后, 鰓部和皮膚LZM活力在5000幼蟲/魚和7500幼蟲/魚這兩組中出現大幅度升高; 而在10000幼蟲/魚組時卻有所降低。這說明在中度感染后, LZM活力升高是機體受到脅迫的指示; 而在高度感染后, 由于組織損傷或病理變化程度較重造成LZM分泌出現紊亂或被抑制。此外值得注意的是, 2500幼蟲/魚這一低濃度感染組LZM活力分別在鰓或皮膚中的第72h或48h出現了短暫的升高后又有所降低。這可能由于寄生蟲要依附宿主才能生存, 因此物種經過長期進化后形成了某種共存機制[21], 比如在較低感染濃度下, 寄生蟲誘使魚體LZM等免疫因子含量在短期內升高, 以控制寄生的蟲體數量和活力, 從而達到某種平衡, 以減輕對魚體的傷害。但詳細情況仍需更多研究加以證明。

綜上可知, 刺激隱核蟲感染會對魚體造成氧化脅迫和脂質過氧化反應, 其嚴重程度與感染的蟲細胞濃度相關。低濃度感染組的魚所受脅迫較輕, 在滋養體脫落后仍具有一定的自我修復能力; 而高濃度感染組魚的免疫因子釋放受到抑制或出現紊亂,即便在蟲體脫落后, 其體質也很難恢復。

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STRESS AND IMMUNE RESPONSES OF THE MARBLED ROCKFISH SEBASTISCUS MARMORATUS INFECTED WITH CRYPTOCARYON IRRITANS

YIN Fei1, GONG Qi-Yang2, SHI Zhao-Hong1, SUN Peng1, PENG Shi-Ming1, GAO Quan-Xin1,
DAN Xue-Ming3and LI An-Xing2
(1. Key Laboratory of East China Sea and Oceanic Fishery Resources Exploitation, Ministry of Agriculture, East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China; 2. Key Laboratory for Aquatic Products Safety of Ministry of Education, State Key Laboratory of Biocontrol, The School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China; 3. College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

To investigate the effects of a Cryptocaryon irritans infection on the biochemical functions and immune responses of the marbled rockfish Sebastiscus marmoratus, this study utilized C. at concentrations of 2,500, 5,000, 7,500, and 10,000 theronts/fish to infect marbled rockfish weighing (45±3) g. Within 96 hours after the infection we measured a variety of parameters at different time points, including (in the serum) cortisol (COR), glucose (GLU), total protein (TP) contens, (in the liver) the malondialdehyde (MDA) and vitamin C (VC) contents, the superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities, and (in the gill and skin) the lysozyme (LZM) activities of the marbled rockfish. The results showed that the serum COR and GLU contents of the marbled rockfish gradually increased along with the infection concentration and the lapse of time after the infection. However, the TP content decreased while infection concentration increased. Compared to the control, MDA contents in the liver decreased significantly in the 5 000 theronts/fish infection group, then increased significantly and reached the maximum in the 10000 theronts/fish infection group. VC contents in the liver initially rose and then dropped. Compared to the control group, the SOD and CAT activities of the fish were significantly elevated. The LZM activities in the gill and skin initially increased and then decreased. In conclusion, C. irritans infection may result in adverse effects on the rockfish, probably through oxidative stress and lipid peroxidation. The physiological functions of the fish infected with low concentrations of C. irritans theronts could be effectively restored after the removal of trophont from the host; however the infection with high concentrations irreversibly impaired the release of immune factors.

Cryptocaryon irritans; Sebastiscus marmoratus; Cortisol; Antioxidant enzyme; Lysozyme

Q175; Q18

A

1000-3207(2014)04-0681-08

2013-05-17;

2013-12-28

國家自然科學基金 (NSFC 31101932; 31272681; 31172443)資助

尹飛(1980—), 男, 內蒙古包頭人; 博士, 副研究員; 從事水產經濟動物病原學研究。E-mail: feige895@gmail.com

李安興, E-mail: lianxing@mail.sysu.edu.cn和0[13]。本研究使用不同濃度的刺激隱核蟲幼體感染褐菖, 通過比較感染后不同時間點褐菖血清中皮質醇 (COR)、血糖 (GLU)、總蛋白 (TP)含量; 肝臟中丙二醛 (MDA)和維生素C (VC) 含量, 超氧化物歧化酶 (SOD) 和過氧化氫酶 (CAT) 活力; 鰓和皮膚溶菌酶(LZM)活力的變化特征, 深入探討魚體的病理變化和生理響應機制。

10.7541/2014.97

刺激隱核蟲 (Cryptocaryon irritans) 俗稱“海水小瓜蟲”, 是一種可以寄生在大多數海水硬骨魚類的纖毛蟲[1]。魚在感染刺激隱核蟲后, 病灶處形成邊緣明顯的白點, 故該寄生蟲病也稱海水魚“白點病”[2,3]。多年來, 隨著海水魚類人工養殖業的發展, 由于養殖密度的增加及養殖管理方面的失誤等問題, “白點病”在海水魚養殖區常有發生, 造成大量養殖魚死亡, 給養殖從業者帶來了極大的經濟損失[4]。

為了探明刺激隱核蟲對魚體的致病機理并找到有效的防治方法, 學者們分別從魚體組織病理學[5]、行為活動、藥物殺蟲[6]、魚體免疫響應機制[7]、抗蟲蛋白效力[8]和保護性抗原篩選[9]等方面進行了大量研究。使用生化指標評定魚體的受損傷程度也是魚類病理、免疫學研究的重要手段[10]。Dan, et al. 向點帶石斑魚(Epinephelus coioides)腹腔注射刺激隱核蟲細胞疫苗并比較了血液中溶菌酶活力的變化規律[11]。而在刺激隱核蟲感染后, 魚體中應激激素含量和免疫酶活力的變化情況仍未見報道。