彌漫大B細胞淋巴瘤預后生物標志物的進展

孫璐，韋立新

（中國人民解放軍總醫院病理科，北京 100853）

彌漫大B細胞淋巴瘤預后生物標志物的進展

孫璐，韋立新

（中國人民解放軍總醫院病理科，北京 100853）

彌漫大B細胞淋巴瘤是一種異質性腫瘤，捕獲與患者預后相關的分子和蛋白標志物，建立生物標志物預后模型來預測患者的不良結局和進行風險分層，對更好地管理患者和指導治療十分重要。

彌漫大B細胞淋巴瘤；預后；生物標志物

彌漫大B細胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins lymphoma，NHL)最常見的一種類型，占西方國家成人NHL的30%～40%。腫瘤具有異質性，在基因改變、臨床特征、形態學表現、對治療的反應和預后等方面存在著差異[1]。DLBCL的標準治療方案，如R-CHOP(利妥昔單抗、環磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松)誘導的完全緩解率超過75%。然而目前的長期無事件生存率為50%～60%，而30%～40%的患者最終死于腫瘤[2]。捕捉反映腫瘤異質性的預測指數，識別無法從現有治療獲益的DLBCL患者，能夠更好地管理患者和指導風險調整后的治療策略[3]。國際預后指數評分(International Prognostic Index，IPI)為DLBCL患者的管理提供預后指導，易于實施，是最重要的臨床預后評估工具之一。即使在利妥昔單抗時代仍是對DLBCL患者進行危險度分層的最有價值的工具。可是，IPI評分并不能完全代表疾病的異質性，即使IPI評分相同的患者預后也存在很大差異[4]。因此，疾病的侵襲性和腫瘤進展的差異與明顯的基因和分子異質性相關。從而，學者們將重點轉移到與患者預后相關的分子和基因標志物的研究，以期建立某種模型來預測DLBCL患者的不良結局和進行風險分層，從而允許在高風險人群中試驗新的治療方法是否能夠改善預后，并且保證研究人群中不會混有那些從標準治療中獲益的患者[5]。本文就國內外文獻中報道較多的生物標志物，尤其是繼基因表達譜分型(Gene expression profiling，GEP)后提出的一系列以免疫組織化學(Immunohistochemistry，IHC)方法模擬基因分型的新的生物預后模型做一綜述。

1 單個預后標志物

淋巴瘤的惡性細胞出現遺傳學和表觀遺傳學的累加變化，導致異常的基因活性和免疫表型，多條信號通路出現異常，使得瘤細胞持續增殖、逃避凋亡、不受抑制增殖和分化信號的調控、侵襲性生長和促進血管生成。以上過程中的任意特殊分子的變化都可能成為腫瘤治療的選擇靶點和與預后相關的標志物[6]。參與細胞循環的調控分子有TP53、p27KIP1、CyclinD和Ki-67，抑制細胞凋亡的蛋白有Survivin、BCL2和Caspases。在B細胞不同分化階段發生腫瘤轉化而形成的DLBCL，表現出細胞表面和細胞內蛋白異質性表達、免疫球蛋白基因不同狀態的突變，提示不同的癌基因起源，包括BCL-6、HGAL、CD10、CD5、FOXP1等，并且這些癌基因標志物與患者預后相關。粘附分子主要參與炎癥部位淋巴細胞的回家和遷移，除正常生理功能外，還在腫瘤侵犯和轉移過程中發揮作用。細胞間粘附分子-1(ICAM-1)和CD44陽性表達的DLBCL患者預后不良。血管生成是指從腫瘤外部的血管生成新的毛細血管，是腫瘤生長超出幾立方毫米的必須步驟，在成人受到多種促進或抑制血管生長的調節蛋白的嚴格調控。外周血檢出高水平Endostatin或血管內皮生長因子(VEGF)的患者預后差。惡性腫瘤細胞外基質過度破壞、新生血管密度增加和腫瘤擴增與缺乏基質金屬蛋白酶(MMP)相關。其他的單個分子預后標志物還有nm23-H1、IL-10、肝細胞生長因子(HGF)和主要組織相容復合物分子。上述單個生物標志物的研究提供了IPI之外的有價值的預后信息，豐富了我們關于淋巴瘤生長病理學機制的知識，但是大量的研究產生了矛盾的結果，不能得出統一的結論。其原因一方面在于多數研究是回顧性研究，存在固有的問題。另一方面，腫瘤的生長是復雜的生物學過程，涉及多個基因、多種信號通路和調節機制，單個基因或分子預測預后的能力有限，不能準確反映惡性腫瘤的異質性。

2 與腫瘤細胞起源相關的GEP分型和相應的免疫組化分型方法

本世紀初，隨著基因芯片技術的運用，Alizadeh等[7]和Rosenwald等[8]根據GEP將DLBCL分為生發中心B細胞樣亞型(Germinal center B cell-like，GCB)、與外周血活化B細胞具有類似基因表達特點的外周血活化B細胞樣亞型(Activated B cell-like，ABC)以及第3型(type 3，特點無法界定)。其中，GCB亞型預后較好，而ABC亞型與第3型預后相似且明顯差于GCB亞型，故歸為一類即非生發中心亞型(non-GCB)。GCB組和non-GCB組的5年生存率分別為76%和16%，差異有顯著統計學意義，這種差異在不同IPI組之間也依然存在。現階段，因GEP技術復雜、價格昂貴、需要新鮮組織等因素不利于臨床推廣應用，所以很多病理學家研究在DLBCL病例中利用免疫組織化學技術模擬基因芯片，對石蠟包埋的組織進行分型，從而推測腫瘤細胞來源和預測臨床結局。

已經報道的多種分型方法中，Hans、Choi和Tally法均來自美國Nebraska大學醫學中心[9-11]。研究者以GEP分型為金標準，分別對CHOP和R-CHOP治療后的DLBCL患者的腫瘤組織芯片(Tissue microarray，TMA)進行不同IHC分型方法與GEP分型一致性的比較，其中Tally法與GEP分型的一致率達93%，被認為一致性最好，Choi法和Hans法的一致率分別為87%和86%。三種IHC分型方法的敏感性和特異性均較好，并且GCB組患者的預后均優于non-GCB組。Hans法最早被提出，目前在臨床應用最為廣泛，該分型法選擇了一組與GCB和non-GCB分型高度相關的IHC抗體作為套餐(包括CD10、BCL-6和MUM1)，并被寫入2008年WHO淋巴造血系統腫瘤分類。有學者針對CHOP治療患者的研究證實了Hans等的發現[12-13]，但是一些研究未能發現Hans分型后的GCB和non-GCB兩組間預后有顯著差異[14-16]。李敏等[15]的研究認為在Hans法的抗體套餐外增加GCET1和FOXP1的Choi法分型與預后顯著相關。有趣的事，Nyman等[12]還發現，Hans法分型與R-CHOP治療后DLBCL患者的預后顯著相關，GCB組預后更好，這與Mayer等[11]的發現相符合。Natkunam等[14]進一步提出以單一的抗體LMO2作為研究因素，結果發現無論是CHOP治療組還是R-CHOP治療組，LMO2陽性表達組患者無進展生存和總體生存明顯優于LMO2陰性組，差異有統計學意義，提示LMO2蛋白表達同LMO2的mRNA表達一樣，對DLBCL患者有預后意義，并且不受治療方式的影響。但是Natkunam法分型與GEP分型的一致性最差。Nyman等[12]選用MUM1和FOXP1兩個代表活化B細胞的標記，只要有一個陽性表達就劃分為活化B細胞亞型，結果發現活化B細胞組較其他病例組的預后差。Muris等[17]選擇CD10、MUM1和BCL-2為IHC套餐對DLBCL進行危險度分層，提示結合了GCB與non-GCB及凋亡蛋白的分組較單純的僅區分細胞來源和僅比較細胞凋亡的分組更能有力預測患者預后，尤其是在高IPI組。盡管Nyman法和Muris法與GEP分型的一致率達到81%和77%，但是前者敏感性過低，而后者特異性較差[11]。Mayer等[11]在Choi法基礎上加入LMO2，作為CD10、GCET1、MUM1和FOXP1后仍無法明確分型時的權重因子，提出新的Tally分型方法；還進一步驗證，全部的分型方法都可以將患者分成總體生存和無事件生存不同的兩組，但每種分型方法的風險比值不同。除了Nyman法，通過其他方法劃分的亞型是獨立于IPI的生存預測因子。

造成各種IHC研究結果不一致的原因，既有生物學因素，又有技術因素。前者是與患者和治療相關的特征，如患者人群的異質性和不同的治療藥物，后者包括染色的差別、TMA切片與整塊組織切片的差別、組織固定、一抗的差異和數據計分的主觀性。在上述各方法中使用的抗體中，BCL-6染色和計數的重復性最差。CD10陽性率低是導致Hans法將GEP分型中的GCB亞型錯分為non-GCB亞型的原因之一。

3 考慮腫瘤微環境影響的GEP研究結果和相應的免疫組化分型方法

Rosenwald等[8]的研究定義了4種基因印跡，它們在DLBCL中發揮不同生物學作用，與CHOP治療后的患者生存相關。“生發中心B細胞”印跡提示預后好，與GCB樣和ABC樣分型平行。“增殖”印跡提示預后差，包括MYC及其目標基因。“主要組織相容復合物Ⅱ”印跡在DLBCL部分亞群的腫瘤細胞中沉默，與預后差相關。“淋巴結”印跡提示預后好，反映了腫瘤微環境的性質，包括細胞外基質成分。由此可見，除腫瘤細胞外，DLBCL背景中非腫瘤細胞的類型和數量，即腫瘤微環境，也發揮著重要的作用，決定患者的預后[18]。最近，Lenz等[19]運用GEP技術研究發現，DLBCL腫瘤微環境中非腫瘤細胞的不同組成成分及其特征可以預測患者的預后，尤其是編碼細胞外基質成分的基因的表達與臨床結局有關。他們命名了兩個重要的基質印跡Stromal-1和Stromal-2。Stromal-1反映細胞外基質的沉積和單核組織細胞的浸潤，預示良好結局；而Stromal-2很大程度上反映了腫瘤間質的血管生成和血管密度，預示不良結局。細胞外基質包括纖維粘連蛋白、骨粘連蛋白(SPARC)、多種膠原和層粘連蛋白Isoforms和抗新生血管因子Thrombospondin。Meyer等[20]用抗SPARC抗體模擬Stromal-1印跡來評估DLBCL微環境中基質細胞和組織細胞的表達，結果顯示腫瘤基質中SPARC陽性表達組比陰性組有更長的生存期，二者差異具有統計學意義。Brandt等[21]發現聯合表達基質標記物纖維粘連蛋白和SPARC的DLBCL患者總生存期更長。Cardesa-Salzman等[22]通過測量DLBCL中的微血管密度模擬Stromal-2印跡，提示微血管密度高是預后差的相關因素。

隨后，有學者又在上述研究腫瘤微環境組成成分差異對DLBCL預后影響的基礎上，結合以往的以腫瘤細胞為主體的分型，提出了一個綜合性的新的生物預后模型[23]。該模型中以non-GCB細胞樣亞型，SPARC陽性細胞＜5%和微血管密度四分位數為4作為預后差的因素，每一個預后差的因素計1分。研究發現：生物計分低(0～1分)的組預后好，而生物計分高(2～3分)的組預后差；提示這一新的生物預后模型可以與IPI評分一起用于DLBCL的危險度分層，并據此開展新的或風險適應性治療。Alizadeh等[24]也認為，通過分別測定一個反映腫瘤細胞來源的基因(LMO2)和一個反映腫瘤微環境的宿主細胞的基因(TNFRSF9)可以有力地預測DLBCL患者的預后。

4 小結

依據不同生物標志物設定的免疫分型方法，對DLBCL患者預后的影響尚存在爭議。尤其是Hans分型方法，雖然目前應用較普遍，但在Hans等[9]認為預后較好的GCB類型中，同樣存在著少部分預后差的病例，不同的研究小組在免疫分型與預后相關性方面的研究結果也存在著分歧。同時本文中綜述的各種生物標志物是否適用于中國人群，尤其是新的結合腫瘤細胞來源與微環境影響的綜合性生物標記物模型，是少數西方研究者針對本地區病例研究后所得，國內尚未見報道。綜上所述，有必要在國內多個中心開展有關DLBCL的多種生物標志物的深入研究，發現那些與中國DLBCL患者預后相關的標志物，為認識中國人群相關疾病特征和開展有針對性的治療提供理論依據。

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Research progress of prognostic biomarkers in diffuse large B-cell lymphoma.

SUN Lu,WEI Li-xin.Department of Pathology,PLA General Hospital,Beijing 100853,CHINA

Diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL)is a heterogenous group of neoplasm.The discovery of specific genetic alterations and the assessment of protein expression lead to the identification of molecular markers capable of predicting the outcome of DLBCLpatients independently of clinical variables and finding better therapeutic target.

Diffuse large B-cell lymphoma;Prognosis;Biomarker

R733.4

A

1003—6350（2014）19—2879—04

2014-05-23)

韋立新。E-mail：73887391@qq.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2014.19.1132