鑒定單增李斯特菌4b血清型亞型的多重PCR方法的建立

王 毅，王 艷，葉正興，代 航，王天殊，賀春月，許華青，葉長蕓

單增李斯特菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性短桿菌，廣泛分布于環境、食品、人和動物宿主體內[1-2]。自20世紀80年代以來，由單增李斯特菌引起的單增李斯特菌病逐漸成為一種重要的食源性疾病[1]。食入被單增李斯特菌污染的食品是引起人類李斯特菌病暴發和散發病例的主要原因[4-5]。孕婦感染后容易導致流產、早產，甚至是胎兒死產；免疫力低下人群則出現發熱性胃腸炎、敗血癥、腦膜炎等嚴重的侵襲性病癥；免疫力正常個體常出現與其它食源性的致病菌感染相似的癥狀，如腹瀉、發熱、嘔吐[6-7]。

在單增李斯特菌的13種血清型(1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、7)中，血清型1/2a、1/2b、4b菌株導致了人類絕大多數的李斯特菌病臨床病例[2]，而4b為優勢致病血清型，其致病率和死亡率遠高于1/2a和1/2b，且絕大多數的暴發菌株為4b[2,10-11]。各種分子分型方法顯示4b血清型的單增李斯特菌具有遺傳多態性，它同屬于3個不同的遺傳家系(Lineage I、Lineage III和Lineage IV)，而3個家系中只有Lineage I的4b菌株與暴發和散發病例有較強的相關性，Lineage III和Lineage IV中的4b型菌株具有截然不同的分子特征[12-14]。目前很多研究根據流行病學和分子生物學特征將4b菌株分為3種流行克隆群ECI、ECII和ECIV(Lineage I)和一種非流行克隆群non-EC(Lineage III和Lineage IV)，ECI、ECII和ECIV主要引起暴發和散發的人類李斯特菌病，non-EC 4b主要分離自動物病例和污染的動物食品[12-15]。

雖然區分部分血清型4b亞型的方法已逐步被建立[16-18]，但這些方法只能檢測出常見的ECI和ECII型，無法將ECIV和non-EC鑒別開。迄今還沒有一個方法能夠同時將單增李斯特菌4b血清型的四個亞型進行有效的區分。本研究的目的在于建立一個多重PCR方法，該方法能夠快速、準確地將流行克隆群的4b菌株和非流行菌株區分開，并同時將流行菌株準確定位到亞型，為單增李斯特菌病的診斷、食品安全評估及可能的感染暴發的病原溯源提供技術支持。

1 材料與方法

1.1菌株 16株單增李斯特菌4b血清型菌株和384株其他血清型(1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4c、4d、4e、7)單增李斯特菌株來自本實驗室，4b血清型菌株的亞型確定參照Liu, D.和Martin, W.等人的分型方法[13,18]。菌株使用前在腦心浸液(BHI)瓊脂平板上37 ℃過夜生長。

1.2試劑與儀器 Mix和細菌基因組提取試劑盒(Bacteria Gene DNA kit)購自北京康為世紀生物科技有限公司；DL100 DNA Marker購自大連寶生物公司。PCR儀(SensoQuest Labcycler)購自德國Senso公司；凝膠成像系統(GEL Doc2000)購自美國Bio-rad公司；引物合成由上海生物工程有限公司完成。

1.3DNA模板制備 細菌基因組提取按試劑盒說明書進行，所制備的菌株DNA模板均保存于-20 ℃備用。

1.4引物設計 本研究包括4個特異目的基因LMOf2365_2798、LMOh7858_0487、ORF2110和gtcA(LMOf2365_2522)。LMOf2365_2798、LMOh7858_0487和ORF2110引物序列來自參考文獻[11,14-15,17]。gtcA引物序列設計根據clustalw2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)多序列比對，選擇4b菌株的特異序列部分見圖1。目的基因的引物序列及其特異性見表1。

圖1運用多序列比對目的基因gtcA進行引物設計

Fig.1DevelopmentoftheprimersetforL.monocytogenesserotype4bidentificationbymultiple-sequencecomparisonofgtcAsequence

The boxes indicate the regions of forward and reverse primers. Left column are isolate identification numbers followed the serotype designations.

表1 實驗用引物序列

1.5gtcA特異性驗證 PCR反應體系(20 μL)：Mix 10 μL、蒸餾水7 μL、gtcA-F和gtcA-R各1μL、模板DNA 1.0 μL。95 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30循環；最后72 ℃延伸5 min。結束后取8 μL PCR擴增產物上樣于1.0%瓊脂糖凝膠，150 V電壓條件下電泳30 min后在凝膠圖像分析系統下觀察結果并拍攝圖像。

1.6多重PCR擴增 PCR反應體系(30 μL)：Mix 26 μL、模板DNA1.5 μL、4對引物濃度分別為：LMOf2365_2798 0.1 μmol/L、LMOh7858_0487 0.17 μmol/L、ORF2110 0.1 μmol/L、gtcA 0.13 μmol/L)。95 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35循環；最后72 ℃延伸5 min。反應結束后取8 μL PCR擴增產物上樣于2.5%瓊脂糖凝膠，130 V電壓條件下電泳80 min后在凝膠圖像分析系統下觀察結果并拍攝圖像。

2 結 果

為了得到預期大小的擴增產物，分別在不同引物濃度下測試4對引物的擴增效率。4對引物的最佳濃度見材料與方法，在此條件下能夠得到高質量的特異性擴增片段。

在所建立的最佳反應條件下，單增李斯特菌4b血清型不同亞型的多重PCR擴增結果良好(圖2)。所有4b血清型實驗菌株都擴增gtcA片段(186 bp)，該基因的特異性使用400株單增李斯特菌加以證實，包括12個血清型(1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4c、4d、4e、7)。其中non-EC亞型菌株僅擴增出gtcA片段；ECI亞型菌株擴增出gtcA、ORF2110和LMOf2365_2798片段；ECII亞型菌株擴增gtcA、ORF2110和LMOh7858_0487；ECIV亞型菌株擴增gtcA和ORF2110片段。

圖2單增李斯特菌4b血清型不同亞型菌株的PCR擴增結果

Fig.2AgarosegelelectrophoresisofthePCRproductsobtainedfrommultiplexPCR

M: 100-bp DNA ladder marker; 1: The ECI strain ofL.monocytogenesserotype 4b; 2: The ECII strain ofL.monocytogenesserotype 4b; 3: The ECIV strain ofL.monocytogenesserotype 4b;

4: The non-EC strain ofL.monocytogenesserotype 4b.

Molecular sizes of ladder marker are given at the left. Genes corresponding to the amplified fragments are listed on the right.

運用本研究建立的多重PCR方法，16株4b血清型單增李斯特菌的4個亞型菌株得到了很好的區分(見表2)。

3 討 論

在單增李斯特菌4b血清型菌株中，ECI、ECII、ECIV菌株主要導致人類李斯特菌病的暴發，歐美國家的幾次主要暴發都是由ECI、ECII、ECIV菌株引起[20-22]。同時這些菌株也經常引起散發病例[23]。而流行病學研究顯示Non-EC很少引起人類李斯特菌病，主要分離自動物病例標本和污染的動物食品[3]。研究表明這些菌株分子流行病學特征與克隆群的劃分具有一致性，Martin Wiedmann等人的多毒力序列位點分型(MVLST)研究發現ECI主要為序列型(Sequence type, ST)ST1和ST93，ECII為ST17，ECIV為ST8和ST29，且ECIV(ST29)為優勢流行克隆群[4]。然而我們研究發現，中國單增李斯特菌4b血清型菌株中，ECI菌株主要為ST1、ECII菌株為ST218、ECIV菌株為ST8，ECI(ST1)菌株為優勢流行克隆群[1]。但通過分子流行病學方法鑒定4b菌株亞型，耗時、耗力且價格昂貴，不適用于食品安全篩查和暴發疫情的應急檢測。基于多重PCR技術的單增李斯特菌4b血清型菌株亞型的鑒定方法快速準確，且能夠實現高通量，對食品安全中病原菌的檢測、流行菌株的監測及暴發菌株的溯源具有重要的應用意義。

表2 多重PCR對單增李斯特菌4b亞型的檢測結果

Note:a--According to the typing methods described by Liu D. and Martin W. et al, the identification ofL.monocytogenesserotype 4b subgroups was achieved.

gtcA為單增李斯特表面抗原相關基因，其產物參與單增李斯特菌胞壁酸的糖基化修飾[24]。通過序列比對發現，該基因存在于所有的單增李斯特血清型中，然而在血清型4b、4d和4e中具有相同的序列。本研究針對gtcA設計的特異性引物(gtcA-F和gtcA-R)作為4b血清型的基因標記，因為血清型4b、4d和4e能夠通過血清凝集進行鑒別。Doumith, M.等發現的ORF2110曾經作為血清型4b、4d和4e的特異性診斷標志[17,19]，然而Liu, D.等研究發現該基因在non-EC 4b菌株中特異性的缺失[12-13]，因此本研究中利用該基因用于鑒別non-EC與ECI、ECII、ECIV亞型。目的基因LMOf2365和LMOh7858在一些研究中證實是ECI、ECII亞型的基因標記[16-17]，其特異性在本研究中得到進一步的證實。

本研究建立的多重PCR方法能夠在一個反應體系中同時鑒別單增李斯特菌4b血清型的4個亞型，實現對ECI、ECII、ECIV和non-EC菌株的快速、準確的診斷。與傳統鑒別單增李斯特菌4b血清型亞型的分子分型方法相比較，我們建立的多重PCR方法結果可靠、操作簡單、適用性廣，在單增李斯特菌流行株的監測、食品安全性評估及暴發疫情的病原學溯源中具有重要的應用價值。

參考文獻：

[1]Schlech WF,Acheson D,Editor S, et al. Foodborne listeriosis[J]. Clin Infect Dis, 2000, 31(3): 770-775. DOI:10. 1086/314008

[2]Vazquez-Boland JA, Kuhn M, Berche P, et al.Listeriapathogenesis and molecular virulence determinants[J]. Clin Microbiol Rev, 2001, 14(3): 584-640. DOI:10. 1128/CMR. 14. 3. 584-640. 2001

[3]Wang Y, Zhao AL, Ye CY, et al. Genetic diversity and molecular typing ofListeriamonocytogenesin China[J]. BMC Microbiol, 2012, 12: 119. DOI:10. 1186/1471-2180-12-119

[4]Hoelzer K, Pouillot R, Dennis S, et al.Listeriamonocytogenesgrowth dynamics on produce: a review of the available data for predictive modeling[J]. Foodborne Pathog Dis, 2012, 9(7): 661-673. DOI:10. 1089/fpd. 2011. 1087

[5]Viswanath P, Murugesan L, Knabel SJ, et al. Incidence ofListeriamonocytogenesandListeriaspp. in a Small-Scale Mushroom Production Facility[J]. J Food Prot, 2013, 76(4): 608-615. DOI:10. 4315/0362-028X. JFP-12-292

[6]Poulsen KP, Czuprynski CJ. Pathogenesis of listeriosis during pregnancy[J]. Anim Health Res Rev, 2013,14(1):30-39.

[7]Bodro M, Paterson DL. Listeriosis in patients receiving biologic therapies[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2013: 4491-4497. DOI:10. 1007/s10096-013-1873-1

[8]Huang B, Eglezos S, Heron BA, et al. Comparison of multiplex PCR with conventional biochemical methods for the identification ofListeriaspp. isolates from food and clinical samples in Queensland, Australia[J]. J Food Prot, 2007, 70(8): 1874-1880.

[9]Swaminathan B, Gerner-Smidt P. The epidemiology of human listeriosis[J]. Microbes Infect, 2007, 9(10): 1236-1243.

[10]Gerner-Smidt P, Ethelberg S, Schiellerup P, et al. Invasive listeriosis in Denmark 1994-2003: a review of 299 cases with special emphasis on risk factors for mortality[J]. Clin Microbiol Infect, 2005, 11(8): 618-624. DOI:10. 1111/j. 1469-0691. 2005. 01171. x

[11]Ronholm J, Van FH, MacKenzie R, et al. Monoclonal antibodies recognizing the surface autolysin IspC ofListeriamonocytogenesserotype 4b: epitope localization, kinetic characterization, and cross-reaction studies[J]. PLoS One, 2013, 8(2): e55098. DOI:10.1371/journal. pone. 0055098

[12]Orsi RH, Den-Bakker HC, Wiedmann M, et al.Listeriamonocytogeneslineages: Genomics, evolution, ecology and phenotypic characteristics[J]. Int J Med Microbiol, 2011, 301(2): 79-96. DOI:10. 1128/AEM. 01127-08

[13]Liu D, Lawrence ML, Gorski L, et al.Listeriamonocytogenesserotype 4b strains belonging to lineages I and III possess distinct molecular features[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(1): 214-217. DOI:10. 1128/JCM. 44. 1. 214-217. 2006

[14]Vasconcelos RM, Almeida AE, Hofer E, et al. Multiplex-PCR serotyping ofListeriamonocytogenesisolated from human clinical specimens[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2008, 103(8): 836-838.

[15]Liu D, Lawrence ML, Wiedmann M, et al.Listeriamonocytogenessubgroups IIIA, IIIB, and IIIC delineate genetically distinct populations with varied pathogenic potential[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(11): 4229-4233. DOI:10. 1128/JCM. 01032-06

[16]Evans MR, Swaminathan B, Graves LM, et al. Genetic markers unique toListeriamonocytogenesserotype 4b differentiate epidemic clone II (hot dog outbreak strains) from other lineages[J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(4): 2383-2390. DOI:10. 1128/AEM. 70. 4. 2383-2390. 2004

[17]Chen Y, Knabel SJ. Multiplex PCR for simultaneous detection of bacteria of the genusListeria,Listeriamonocytogenes, and major serotypes and epidemic clones ofL.monocytogenes[J]. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(19): 6299-6304. DOI:10. 1128/AEM. 00961-07

[18]Den-Bakker HC, Fortes ED, Wiedmann M, et al. Multilocus sequence typing of outbreak-associatedListeriamonocytogenesisolates to identify epidemic clones[J]. Foodborne Pathog Dis, 2010, 7(3): 257-265. DOI:10. 1089/fpd. 2009. 0342

[19]Doumith M, Buchrieser C, Glaser P, et al. Differentiation of the majorListeriamonocytogenesserovars by multiplex PCR[J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(8): 3819-3822. DOI:10. 1128/JCM. 42. 8. 3819-3822. 2004

[20]Kathariou S.Listeriamonocytogenesvirulence and pathogenicity, a food safety perspective[J]. J Food Prot, 2002, 65(11): 1811-1829.

[21]Chen Y, Zhang W, Knabel SJ, et al. Multi-virulence-locus sequence typing identifies single nucleotide polymorphisms which differentiate epidemic clones and outbreak strains ofListeriamonocytogenes[J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(3): 835-846. DOI:10. 1128/JCM. 01575-06

[22]Goulet V, King LA, Vaillant V, et al. What is the incubation period for listeriosis[J]. BMC Infect Dis, 2013, 13: 11.

[23]Sauders BD, Schukken Y, Kornstein L, et al. Molecular epidemiology and cluster analysis of human listeriosis cases in three U. S. states[J]. J Food Prot, 2006, 69(7): 1680-1689.

[24]Promadej N, Fiedler F, Cossart P, et al. Cell wall teichoic acid glycosylation inListeriamonocytogenesserotype 4b requiresgtcA, a novel serogroup-specific gene[J]. J Bacteriol, 1999, 181(2): 418-425.