K-RAS和DCC在直結腸癌中的表達及意義

熊 慧，張阿偉，范貴民，扈清云

（佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯154007）

直結腸癌的發(fā)生經(jīng)歷了一系列組織學變化的過程，每一個階段都伴隨著特定的遺傳變異。一般來說，直結腸腫瘤的形成需要兩個必要條件，一是存在一個適合早期突變細胞無限克隆擴增的環(huán)境，二是腫瘤相關基因的不穩(wěn)定性。KRAS基因突變的常見方式為點突變，突變位點好發(fā)于1號外顯子的第12位、第13位密碼子上，其突變型可為半胱氨酸、纈氨酸、精氨酸，突變的發(fā)生導致編碼的氨基酸序列發(fā)生改變，從而編碼出致癌蛋白p21，p21蛋白能夠刺激細胞生長、發(fā)育和增殖，進而誘發(fā)細胞癌變，已有研究表明p21蛋白誘發(fā)直結腸癌。DCC基因編碼的DCC蛋白主要由胞內多肽和胞外多肽兩部分組成，胞外多肽的氨基酸順序與神經(jīng)細胞黏附因子（neural cell adhesion molecule，NCAM）極其相似，當抑癌基因DCC缺失，不能編碼DCC蛋白之后，細胞生長及分化發(fā)生障礙，此時細胞即可發(fā)生惡變。本研究采用免疫組織化學法，我們將同步檢測68例直結腸癌中癌基因KRAS和抑癌基因DCC的表達情況，以期找到它們之間的相關性，為直結腸癌的早期無創(chuàng)或微創(chuàng)性診斷提供一定的理論依據(jù)。K-RAS和DCC表達是否與腫瘤組織分型、浸潤轉移相關，是否可作為判斷直結腸癌生物學行為的一個指標，從而為直結腸癌的診斷和治療提供新的生物學標記和腫瘤基因治療的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

收集佳木斯大學附屬第一醫(yī)院2011～2013年手術切除的直結腸癌組織標本68例，直腸癌標本中男44例，女24例，31～80歲，平均58.5歲。良性病變組織標本45例，均為明確診斷病例，組織樣本及時用10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制片厚4～5μm，進行免疫組織化學染色。

1.2 主要試劑

K-RAS、DCC兔來源多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，采用該公司SP系列免疫組化試劑盒檢測。

1.3 實驗方法

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，采用SP試劑盒法，按說明步驟處理，一抗分別為K-RAS、DCC兔來源多克隆抗體，工作濃度為1：200，滴加后4℃冰箱孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片。陰性對照用PBS代替一抗。

1.4 結果判定

K-RAS陽性細胞分步彌散，染色位于包膜和胞質；DCC蛋白陽性染色主要位于細胞質內，以上染色均呈棕黃色細顆粒狀。判斷標準：顯微鏡鏡下（×100）5個視野中平均陽性細胞所占比例，＞10%的癌細胞胞質中或包膜呈棕黃色，淺黃色者定為弱陽性，計入陽性［1］。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，各組數(shù)據(jù)采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 K-RAS在直結腸癌中及良性病變組織的表達

68例直結腸癌病例中，K-RAS表達陽性42例，陽性率為61.8%，其中腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移情況及組織學類型的表達率差異不顯著，45例良性病變組織中，KRAS表達陽性14例，陽性率為31.1%。直結腸癌組與良性病變組比較差異極顯著（P＜0.01）。

2.2 DCC在良性病變組織及直結腸癌中的表達

68例直結腸癌病例中，DCC表達陽性5例，陽性率為7.4%，45例良性病變組織中，DCC表達陽性41例，陽性率為91.1%。直結腸癌病例中，不同臨床病理特征表達陽性率差異不顯著。直結腸癌組與良性病變組比較差異極顯著（P ＜0.01）。

3 討論

Ras基因在人類的第12號染色體發(fā)現(xiàn)，在5'端包含4個編碼區(qū)外顯子和1個非編碼區(qū)外顯子，能夠編碼含189個氨基酸組成的ras蛋白，其相對分子量為21×103，故命名為p21蛋白。K-RAS基因突變的常見方式為點突變，突變位點好發(fā)于1號外顯子的第12位、第13位密碼子上，其突變型可為半胱氨酸、纈氨酸、精氨酸，突變的發(fā)生導致編碼的氨基酸序列發(fā)生改變，從而編碼出致癌蛋白p21，p21蛋白能夠刺激細胞生長、發(fā)育和增殖，進而誘發(fā)細胞癌變［2］，K-RAS的基因突變時，鳥苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase）活性降低，p21蛋白GTP結合牢固，不易被GTPase水解，p21蛋白長期處于激活狀態(tài)，進而持續(xù)刺激細胞生長、發(fā)育和增殖，最終誘發(fā)大腸癌［3］。在非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）患者中發(fā)現(xiàn)RAS基因的擴增［4］，研究表明，K-RAS基因過表達明顯降低自然殺傷細胞（natural killer cell，NK細胞）對腫瘤的殺傷作用，可作為大腸癌轉移，病情惡化的特征［5］。本研究中，K-RAS在直結腸癌組織中高表達，對于直結腸癌的臨床診斷有一定的意義，因此，我們認為，如果在直結腸病變組織中檢測K-RAS蛋白，則有利于直結腸癌的早期診斷，進一步研究未發(fā)現(xiàn)其表達與直結腸癌臨床病理特征的相關性，這與已有研究報道一致［6］。

DCC基因位于18號染色體，基因全長1400kb，包含29個外顯子，能夠編碼含1447個氨基酸的跨膜蛋白，DCC基因編碼的DCC蛋白主要由胞內多肽和胞外多肽兩部分組成，胞外多肽的氨基酸順序與神經(jīng)細胞粘附因子（neural cell adhesion molecule，NCAM）極其相似，當抑癌基因DCC缺失，不能編碼DCC蛋白之后，細胞生長及分化發(fā)生障礙，此時細胞即可發(fā)生惡變［4］。研究表明，DCC基因失活與直結腸癌的浸潤程度及轉移呈正相關［9］，本研究中，DCC蛋白在直結腸癌中缺失率為92.6%，DCC的編碼產物與黏附分子具有同源性，它的缺失應該會增加腫瘤細胞的侵襲力，但我們未發(fā)現(xiàn)其表達與腫瘤的侵襲轉移能力有關，其相關性還有待于進一步研究揭示。相應DCC蛋白的缺失率明顯增加，我們認為這對于研究直結腸癌的演變及進展具有重要意義。盡管目前對K-RAS和DCC基因的研究有了很大的進步，但是關于K-RAS和DCC基因的失活機制、K-RAS和DCC蛋白的功能、K-RAS和DCC基因與其它基因是如何協(xié)同作用與直結腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中K-RAS和DCC基因誘導細胞分化的機制尚未完全清楚。K-RAS基因失活的同時DCC蛋白表達缺失是否能夠用于指導臨床早期診斷，是否關系直結腸癌腫瘤組織病理分型、腫瘤分期仍待于進一步探究。腫瘤發(fā)生可能是癌基因突變和抑癌基因失活共同作用的結果，目前尚無報道聯(lián)合檢測K-RAS和DCC表達情況，我們發(fā)現(xiàn)在直腸癌組織中，K-RAS呈高表達，DCC則呈缺失表達，從而我們認為以上兩種因素的協(xié)同調控直結腸癌的發(fā)生，K-RAS基因突變和DCC基因表達缺失與直結腸癌的發(fā)生關系密切，能夠在分子水平判斷直結腸癌生物學行為。這為直結腸癌的診斷和治療提供新的生物學標記和腫瘤基因治療的靶點。

［1］仇容，陳增良，司馬軍，等.DCC、P53及VEGF在結直腸腺癌癌組織中的表達［J］.基礎醫(yī)學與臨床，2005，8

［2］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA：a cancer journal for clinicians，2011，61：69-90

［3］Hara N，Ishizaki F，Saito T，et al.Decrease in lean body mass in men with prostate cancer receiving androgen deprivation therapy：mechanism and biomarkers［J］.Urology，2013，81：376-380

［4］Espinosa D，Baamonde C，Illana J，et al.Lung cancer in patients with lung transplants［J］.Transplantation proceedings，2012，44：2118-2119

［5］Minamoto T，Mai M，Ronai Z.K-ras mutation：early detection in molecular diagnosis and risk assessment of colorectal，pancreas，and lung cancers-a review［J］.Cancer detection and prevention，2000，24：1-12

［6］Gonzalez-Aguilera JJ，Oliart S，Azcoita MM，et al.Simultaneous mutations in K-ras and TP53 are indicative of poor prognosis in sporadic colorectal cancer［J］.American journal of clinical oncology，2004，27：39-45