長鏈非編碼RNA MEG-3抑癌作用的研究進展

姜艷芝，張連峰

(鄭州大學第一附屬醫院消化內科 河南鄭州 450052)

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200 nt的非編碼RNA分子，在基因組印記、轉錄和轉錄后水平發揮重要的調控作用。人母系表達基因(Maternally Expressed Gene 3，MEG-3)是一種母系印記基因編碼的lncRNA，近年研究發現其在多種人類腫瘤中發揮抑癌作用，進一步的研究證實其發揮抑癌作用與DNA甲基化、p53基因表達、Rb途徑、cAMP途徑以及影響血管生成有關。本文總結了近年來國內外關于MEG-3的研究報道，對其在腫瘤中的抑癌作用做一綜述，希望為lncRNA在腫瘤中的診斷及治療提供新的思路。

1 lncRNA概述

最新的全基因組調查及高通量轉錄組分析發現，人類基因組只包括大約20 000個蛋白編碼基因，僅占總基因組的1%～2%，剩余可以穩定轉錄的部分稱為非編碼RNA，包括管家非編碼RNA(如tRNA、rRNA及snoRNA等)和調節性非編碼RNA［1］。調節性非編碼RNA按其長度可分為短鏈非編碼RNA和lncRNA。近年來關于短鏈非編碼RNA的研究較多，如miRNA、siRNA、piRNA廣泛參與到許多生命過程，包括胚胎發育，機體新陳代謝，細胞增殖、分化、凋亡等，并與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關［1-2］。而lncRNA的研究相對起步較晚。

lncRNA是一類轉錄長度超過200 nt的非編碼RNA分子，由于缺乏開放讀碼框而不能編碼蛋白質。越來越多的研究表明，lncRNA廣泛參與到不同的細胞生理過程，通過多種機制參與X染色體沉默、基因組印記、染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾以及核內運輸等［3］。另外，lncRNA還在細胞發育和分化中扮演重要的角色，并參與調節腫瘤的增殖和侵襲以及重組誘導多能干細胞［4-5］。失調的lncRNA已被證明參與多種腫瘤的形成及發展，如乳腺癌［4］、肝細胞癌［6］、膀胱癌［7］、胰腺癌［8］、肺癌［9］、腦膜瘤［10］等。其中 lncRNA HOTAIR已被確認與乳腺癌、肝癌、胰腺癌患者的預后密切相關，并影響乳腺癌的轉移［4，6，8］。近期的研究結果提示，lncRNA在腫瘤的形成中發揮原癌基因(如ANRIL)和抑癌基因(如 MEG-3)的作用［11-12］。

2 MEG-3結構與功能概述

MEG-3是小鼠母系印記基因Gtl2的人類同系物，首次識別于小鼠12號染色體末端［13］。有研究表明，Gtl2的表達和調控在胚胎發育和出生后的生長發育中發揮重要作用［14］。MEG-3定位于人類染色體14q32.3，長約 1.6 kb，只在母源性基因上表達，基因組結構分析發現MEG-3/Gtl2由10個外顯子組成［15］，可通過可變剪切形成多種mRNA亞型。

研究發現，MEG-3在人類多種正常組織高表達，如垂體和腦組織;在胎盤、腎上腺、胰腺、卵巢中也有表達［16］。近期研究表明，MEG-3 在胃癌［17-18］、肝癌［19］、膀胱癌［7］、肺癌［9］、腦膜瘤［10］和非功能性垂體腺瘤［16］中表達下調，并與腫瘤的發生和發展有關。MEG-3的啟動子區域富含CpG核苷酸，有資料表明，差異甲基化區域的高甲基化與腫瘤發生中的MEG-3沉默關系密切［10］。這些數據表明，MEG-3可能在一個特定的腫瘤發病機制中扮演重要的角色，但其發揮抑癌作用的具體機制仍在探索中。近年的研究發現，MEG-3發揮抑癌作用與DNA甲基化、p53基因表達調控、Rb途徑、cAMP途徑以及血管生成相關，通過多種途徑共同調節，參與到抗腫瘤細胞的增殖及轉移過程中。

3 MEG-3作用機制研究

近年來，研究者在MEG-3的功能方面做了大量的研究。Zhao等［16］發現在無功能性垂體腺瘤中MEG-3表達缺失，進一步的檢測發現在MEG-3第一外顯子上游區域啟動子的甲基化水平較正常垂體明顯升高，而經甲基化抑制劑處理后，MEG-3的表達可以恢復，研究者由此推測MEG-3的表達與甲基化水平相關。Lu等［9］發現MEG-3在非小細胞肺癌組織和細胞系中表達下調，上調MEG-3后p53基因活性增高，提示MEG-3可能通過p53途徑抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，并促進其凋亡。Braconi等［19］發現，MEG-3可作為miR-29的靶分子調控肝癌細胞的生長。胃癌相關研究發現，MEG-3下調與不良預后和促進細胞增生有關，還發現miR-148a可以通過甲基化調控MEG-3，進而影響胃癌的進展［17-18］。另外，在膀胱癌［7］、無功能性垂體腺瘤［16］、急性白血病和多發性骨髓瘤［20］等方面均做了大量研究，研究結果顯示，MEG-3可通過多種途徑在眾多人類腫瘤中發揮抑癌作用。

3.1 MEG-3與甲基化狀態 甲基化是表觀遺傳學的一種重要調控形式，目前已經證實，DNA甲基化與腫瘤發生密切相關。MEG-3在多種人類腫瘤中表達缺失，與MEG-3啟動子區域的高甲基化以及基因間的差異甲基化區域(DMR)關系密切［6，9］。Zhao 等［16］發現MEG-3在人類垂體無功能性腺瘤中表達缺失，然而其基因組未發現明顯異常。經檢測發現，MEG-3基因5’端富含CpG二核苷酸，其中大量DNA發生甲基化，提示甲基化在MEG-3表觀遺傳調控中可能發揮重要作用。進一步的研究顯示，將腫瘤細胞暴露于去甲基化藥物后發現MEG-3恢復表達，提示MEG-3基因功能區域的DNA甲基化與其在垂體無功能性腺瘤中的表達缺失有關。Benetatos等［20］也證實，在急性髓系白血病(AML)患者和骨髓增生異常綜合征(MDS)患者中，MEG-3差異甲基化區域的CpG島甲基化與沒有發生甲基化的對照組相比，總體生存率明顯下降，但對AML患者的影響更為顯著。此外，繼發于 MDS的AML患者中約有50%發生MEG-3甲基化，而MDS患者僅有34.9%。這些發現表明，MEG-3異常甲基化可能與疾病的進展有關［20］。

3.2 MEG-3與p53途徑 抑癌基因p53在腫瘤抑制中起著核心作用，并且能夠介導許多其他抑癌因子的功能。p53蛋白是一個不穩定的小分子蛋白，主要在核內發揮作用，可誘導細胞周期停滯、復制性衰老及凋亡［21］。小鼠雙微基因2(MDM2)是細胞內調節p53蛋白濃度及活性的重要基因，MDM2和E3泛素連接酶的調節作用可促進p53降解［21］。Zhou等［21］利用結腸癌細胞系和骨肉瘤細胞系的研究發現轉染MEG-3及其亞型結構后p53蛋白的表達水平顯著增加，同時可以刺激p53應答的啟動子轉錄。進一步的研究發現，MEG-3可以通過促進p53與生長轉化因子(Growth differentiation factor，GDF)基因啟動子的結合刺激GDF15的表達。然而MEG-3對P21CIP1的表達無明顯影響，提示 MEG-3能調節 p53特定的轉錄活性。p53的降解主要由 MDM2介導，通過細胞轉染上調MEG-3的表達后MDM2的水平下降，提示MDM2至少部分介導了MEG-3對p53的調節作用。研究還發現，MEG-3在 p53缺失時仍可以抑制細胞增生，說明MEG-3作為一個抑癌因子，其發揮作用除了可通過p53依賴途徑外，還存在其他的調節途徑。

3.3 MEG-3與Rb途徑 視網膜母細胞瘤Rb基因是一個經典的腫瘤抑制基因，位于染色體13q14.2，主要參與細胞周期調控、細胞分化、衰老和凋亡［22］。這個基因的產物核磷酸化蛋白pRb可以控制細胞G期進入S期，導致細胞G1期停滯［22］。pRb的功能隨磷酸化水平的變化呈周期性改變，pRb是否具有功能取決于其磷酸化的水平，低磷酸化是其活化狀態［22］。已有研究證明MEG-3可以抑制腫瘤細胞的增生。Zhang等［23］發現，在抑癌基因p53缺失時，Rb16在MEG-3介導的抑制腫瘤細胞增生中發揮著重要的作用。MEG-3可通過直接靶向作用于Rb以及通過調控Rb的正性調控因子p16-INK4影響Rb的磷酸化水平，進而發揮其抑制腫瘤細胞增生的作用。由此看來，MEG-3除通過p53依賴和非p53依賴途徑外，也可能通過Rb相關的其它途徑發揮抑癌作用。

3.4 MEG-3與cAMP 環磷酸腺苷(cyclic AMP，cAMP)是一個普遍存在的第二信使，通過cAMP依賴的蛋白激酶激活能力增加各種靶蛋白的磷酸化水平，進而調節細胞的生長、分化和凋亡［24］。研究結果顯示，經cAMP處理的人類成纖維細胞HS-27的MEG-3 mRNA水平與未處理組相比大幅增高，這個結論表明MEG-3抑制細胞增生的功能可能與cAMP有關［25］。基因缺失和突變分析結果表明，在MEG-3啟動子區域的近端-69～-49之間存在一個 cAMP反應元件(CREB)結合位點，在MEG-3的啟動子活化過程中發揮著重要的作用［25］。另外，Northern blot分析證明在人類成纖維細胞系中提高cAMP的表達水平可以刺激MEG-3的表達。進一步的研究發現，凝膠轉移、芯片分析以及共轉染試驗證明，CREB可以直接結合于CRE位點并刺激 MEG-3啟動子的活性［25］。由此說明，MEG-3是cAMP的一個下游靶基因。另一方面，啟動子高甲基化可以阻止cAMP反應元件結合蛋白家族與其結合，最終抑制MEG-3的轉錄［25］。綜合分析發現，MEG-3可能通過cAMP依賴的途徑參與調節細胞增殖以及其他cAMP相關的功能調節。

3.5 MEG-3與血管生成 腫瘤新生血管形成是腫瘤進展的重要因素之一，近期的研究發現lncRNA通過缺氧誘導因子(HIF)、VEGF/VEGFR、Ang/tie和Notch信號參與血管生成［26］。Gordon 等［26］研究證實，MEG-3可促進腦血管的形成。研究者通過對比MEG-3敲除型小鼠和MEG-3野生型小鼠的基因表達譜，發現在MEG-3敲除型小鼠中，血管內皮生長因子(VEGF)信號通路中的Vegfa、Vegfr1、Iqgap1和Was1上調明顯，同時Notch信號通路Hes1和Dll4的表達也明顯增高。既往研究已經證實，VEGF信號通路可調控血管內皮細胞的增殖、存活和遷移，Notch信號通路能夠增加新生血管的穩定性，調控細胞的分化和遷移。敲除MEG-3后解除了MEG-3對VEGF和Notch的抑制作用后腦血管生成增加，說明MEG-3對腫瘤血管生成的潛在抑制作用是其抑制腫瘤發生和發展的機制之一。

4 結語

總之，在過去的幾年中，研究者在MEG-3的功能方面做了大量的研究。在非小細胞肺癌［9］、肝癌［19］、胃癌［17-18］、膀胱癌［7］、無功能性垂體腺瘤［16］以及急性白血病和多發性骨髓瘤［20］等多個人類腫瘤中均發現MEG-3的表達異常。對于MEG-3的深入研究進一步揭示了lncRNA在生物學方面的作用及機制，關于lncRNA和miRNA調控關系的研究也為探索非編碼RNA的調控網絡提供了新的方向。綜合目前的研究，對于MEG-3在多種疾病中的功能已經做出了較為廣泛的研究，然而其作用的具體機制以及與其他轉錄因子、非編碼RNA等的轉錄調控關系的研究還不夠深入。另外，已經發現MEG-3對腫瘤的生物學特性有明確的影響，那么其在腫瘤的治療中又有怎樣的價值，值得我們深思及進行更深一層的研究。

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