對乙酰氨基酚誘導(dǎo)小鼠藥物性肝損傷中PCNA的表達(dá)

趙 瓊，符曉楠，李三強(qiáng)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

對乙酰氨基酚誘導(dǎo)小鼠藥物性肝損傷中PCNA的表達(dá)

趙 瓊1，符曉楠2，李三強(qiáng)3

目的研究對乙酰氨基酚(Acetaminophen,AAP)誘導(dǎo)的小鼠藥物性肝損傷過程中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)的動態(tài)變化，進(jìn)一步闡明PCNA在藥物性肝損傷中的重要作用。方法利用AAP溶液(550 mg/kg)腹腔注射誘導(dǎo)小鼠藥物性肝損傷。取正常對照小鼠和注射AAP后6、24、48、72 h的小鼠肝臟制備勻漿液，利用蛋白印跡的方法檢測小鼠肝損傷過程中PCNA的表達(dá)變化；同時檢測各時間點(diǎn)小鼠血清中AST和ALT酶活變化。結(jié)果小鼠注射對乙酰氨基酚后，血清中AST和ALT酶活逐漸升高，24 h達(dá)到高峰后逐漸降低，72 h恢復(fù)到接近正常水平。PCNA在注射對乙酰氨基酚后6 h，其表達(dá)量顯著下降，在24 h表達(dá)量達(dá)到最低值，隨著損傷后的修復(fù)，PCNA的表達(dá)量逐漸增高，72 h逐漸恢復(fù)接近正常水平。結(jié)論P(yáng)CNA在AAP誘導(dǎo)的小鼠藥物性肝損傷過程中表達(dá)出現(xiàn)顯著變化，AAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷過程存在一個損傷與修復(fù)逐漸變化的過程。

PCNA；對乙酰氨基酚；藥物性肝損傷

乙酰氨基酚(AAP)在大劑量使用時，可引起人和動物嚴(yán)重的藥物性肝臟損傷，學(xué)界已有一些對其相關(guān)機(jī)制的研究，但關(guān)于AAP引起藥物性肝損傷過程中具體的分子機(jī)制還未有深入的研究。PCNA(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)又稱增殖細(xì)胞核抗原，是反應(yīng)細(xì)胞增殖狀況的一個重要的指標(biāo)，常被用作分析肝臟損傷與修復(fù)的情況[1]。本研究重點(diǎn)分析PCNA在AAP誘導(dǎo)的小鼠藥物性肝損傷過程中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究因AAP誘發(fā)的藥物性肝損傷的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心提供昆明種SPF小鼠，體質(zhì)量(22±2) g；AAP購自廣州白云山制藥廠；PCNA鼠源性單抗由北京中杉公司從Santa Cruz公司代購；HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗購自北京中杉公司；中生北控公司提供AST和ALT酶活檢測試劑盒；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 AAP誘導(dǎo)小鼠藥物性肝損傷動物模型 利用AAP溶液(550 mg/kg)腹腔注射小鼠誘導(dǎo)小鼠藥物性肝損傷(n=24)。取正常對照小鼠(n=6)和注射AAP后6、24、48、72 h的小鼠肝臟制備勻漿液，每個時間點(diǎn)6只小鼠，利用蛋白印跡的方法檢測小鼠肝損傷過程中PCNA的表達(dá)變化。同時檢測正常和注射AAP后各時間點(diǎn)小鼠血清中AST和ALT酶活變化。

1.2.2 AST和ALT酶活性檢測 小鼠血清AST和ALT酶活情況參照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.2.3 蛋白印跡法檢測小鼠肝損傷過程中PCNA的表達(dá)情況 利用Bradford方法對蛋白進(jìn)行定量，取70 μg蛋白進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，而后利用脫脂奶粉(5%)進(jìn)行封閉，利用PBS/Tween20洗膜后加入PCNA一抗(1∶800)，37℃孵育1 h后再利用PBS/Tween20洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶800)，37℃孵育1 h后加入DAB進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1 AST和ALT酶活性檢測結(jié)果AAP注射小鼠后，隨著藥物作用時間的延長，血清中AST和ALT酶活性顯著增高，在24 h達(dá)到最大值，然后逐漸降低，72 h恢復(fù)到接近正常水平，驗證小鼠AAP誘導(dǎo)藥物性肝損傷模型成功。

2.2 蛋白印跡檢測結(jié)果在小鼠注射對乙酰氨基酚后PCNA表達(dá)的相對積分光密度值0 h(3.1±0.42)，6 h(2.4±0.32)，24 h(1.3±0.23)，48 h(2.5±0.39)，72 h(3±0.44)。PCNA在注射對乙酰氨基酚后6 h，其表達(dá)量顯著下降，在24 h表達(dá)量達(dá)到最低值，隨著損傷后的修復(fù)，PCNA的表達(dá)量逐漸增高，72 h逐漸恢復(fù)接近正常水平，蛋白印跡結(jié)果經(jīng)Gel Pro4.0軟件分析蛋白條帶后得出的積分光度值，Beta-actin作為內(nèi)參。

3 討論

本文研究了AAP誘導(dǎo)的小鼠藥物性肝損傷過程中PCNA的表達(dá)變化，初步闡明了PCNA在藥物性肝損傷過程中的重要作用。

由于PCNA主要在細(xì)胞周期的S期合成，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。因此，PCNA常被用作檢測細(xì)胞增殖的一個重要的指標(biāo)[2-5]。通過檢測AAP誘導(dǎo)的小鼠藥物性肝損傷過程中PCNA的表達(dá)情況來反映肝臟損傷與修復(fù)的情況。PCNA在AAP誘導(dǎo)的小鼠藥物性肝損傷過程中表達(dá)呈顯著變化趨勢，PCNA在小鼠注射對乙酰氨基酚后6 h，其表達(dá)量顯著下降，在24 h表達(dá)量達(dá)到最低值，說明注射AAP后0～24 h時間段，AAP可能通過抑制細(xì)胞增殖而造成肝臟的損害；而后PCNA的表達(dá)量逐漸增高，72 h逐漸恢復(fù)接近正常水平，說明隨著肝臟損傷后的修復(fù)，PCNA表達(dá)量增高，肝細(xì)胞通過增殖來補(bǔ)償修復(fù)損傷的肝組織。

總之，本文初步研究了PCNA在AAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷過程中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究AAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

[1]Celis JE,Madsen P,Celis A,et a1.Cyclin (PCNA,auxiliary protein of DNA polymerase delta) is a central component of the pathway(s) leading to DNA replication and cell division[J].FEBS Lett,1987,220 (1): 1-7.

[2]Kelman Z.PCNA:structure,functions and interactions[J].Oncogene,1997,14 (6): 629-640.

[3]Morrow PW,Tung HY,Hemmings HC Jr.Rapamycin causes activation of protein phosphatase-2A1 and nuclear translocation of PCNA in CD4+ T cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,323 (2):645-651.

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[5]Xu CS,Lu AL,Xiong L,et a1.Changes of ACP,AKP,HSC70/HSP68 and PCNA in growth and development of rat liver[J].Dev Reprod Biol,2000,9(2):1-14.

ExpressionAnalysisofPCNADuringDrug-inducedLiverInjuryInducedbyAcetaminopheninMice

ZHAO Qiong,FU Xiao-nan,LI San-qiang

(First Affiliated Hospital，Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo study the dynamic changes of PCNA during drug-induced liver injury induced by acetaminophen in mice and further clarify the important roles of PCNA in the drug-induced liver injury.Methods24 healthy male mice were injected intraperitoneally acetaminophen solution (diluted with saline,550 mg/kg).Eye blood was respectively collected at 6,24,48,72 h after acetaminophen injection.Serum was separated,and then AST and ALT activity were measured.At the same time,the livers of mice were prepared for 10% liver homogenate.Six mice were used at each time point.At the same time,six normal mice were used as controls.Western blotting was used to detect the expression changes of PCNA during acute liver injury in mice.ResultsAST and ALT activity were gradually increased with time delayed and got to the peak levels at 24 h,then gradually recovered to the normal level at 72 h after acetaminophen injection.The expression of PCNA was significantly decreased at 6 h and got to the lowest level at 24 h.Then the amount of PCNA expression gradually returned to normal level at 72 h after AAP injection.ConclusionThe expression of PCNA is significantly changed during drug-induced liver injury induced by acetaminophen in mice,which indicates that the process of acute liver induced by AAP includes gradual process of injury and repair.

PCNA；acetaminophen；acute liver injury

河南省高校科技創(chuàng)新人才支持計劃資助項目(13HASTIT025)

2013-12-15

1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽 471003 2.洛陽市澗西區(qū)婦幼保健中心，河南洛陽 471003 3.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 471003

趙瓊(1972-)，女，河南洛陽人，護(hù)師，從事肝臟損傷與修復(fù)研究工作。

李三強(qiáng)，副教授，E-mail: Sanqiangli2001@163.com

R634

A

1672-688X(2014)01-0001-02