疫苗佐劑的研究進(jìn)展

李丹 陳陽 劉宇 王爽 王巖 秦明偉 史同瑞

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所 黑龍江 齊齊哈爾 161000）（哈爾濱鐵路獸醫(yī)衛(wèi)生處 哈爾濱 150006）

佐劑最早來源于拉丁語“adjuvare”一詞，為“幫助”，是指能夠提高機(jī)體對抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的物質(zhì)，能夠在免疫反應(yīng)中誘導(dǎo)全面持久的免疫應(yīng)答。在疫苗制劑中，佐劑的功能主要包括：增強(qiáng)疫苗抗原的免疫原性；促進(jìn)細(xì)胞免疫和體液免疫，優(yōu)化免疫應(yīng)答，促進(jìn)免疫能力較弱人群中的免疫應(yīng)答；增進(jìn)抗原與黏膜之間的傳遞以及免疫接觸；減少疫苗成分中抗原的需求量以及在實(shí)施過程中的免疫接種次數(shù)；優(yōu)化抗原結(jié)構(gòu)，維持抗原構(gòu)象等。

從巴斯德至今近百年來已開發(fā)了許多菌苗和疫苗，但傳統(tǒng)的疫苗一般多為全菌或全病毒制成,其中含有大量非免疫原性物質(zhì)，這些物質(zhì)除具有毒副作用外也有佐劑作用，所以一般不需要外加佐劑。因此，很長一段時(shí)間以來主要是研究毒素、類毒素、抗毒素的學(xué)者在研究和使用佐劑。直到1925年，法國免疫學(xué)家兼獸醫(yī)學(xué)家Gaston Ramon發(fā)現(xiàn)如果在白喉和破傷風(fēng)疫苗中加入某些與之無關(guān)的物質(zhì)可以特異地增強(qiáng)機(jī)體的抵抗反應(yīng)，從此佐劑引起了人們的注意，許多國家也開始不同程度的開展了這方面的研究。

1.傳統(tǒng)佐劑

1.1 鋁佐劑

鋁佐劑是目前獸用疫苗和人用疫苗上應(yīng)用最廣泛的佐劑。鋁佐劑苗可以分為鋁沉淀疫苗和鋁吸附疫苗兩種，鋁沉淀疫苗是將鋁劑懸液加至抗原液中，鋁吸附疫苗是將抗原溶液加至氫氧化鋁或磷酸鋁中。兩種鋁佐劑疫苗不僅能夠減少抗原用量，還能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。鋁佐劑通常用氫氧化鋁，其次是明礬及磷酸三鈣。

1926 年，Glenny發(fā)現(xiàn)用明礬沉淀的白喉類毒素懸液要比類毒素本身具有更高的抗原性，免疫豚鼠取得了較強(qiáng)的免疫效果。1931年，Glenny等又報(bào)道了氫氧化鋁吸附抗原制成的疫苗在注射部位具有緩慢釋放的功能，就此提出氫氧化鋁佐劑的作用機(jī)制為儲(chǔ)存庫效應(yīng)。然而在1950年，Holteta首次對此機(jī)制提出質(zhì)疑。長期以來關(guān)于鋁佐劑疫苗的具體機(jī)制尚不明確，但目前Glenny理論是對于鋁佐劑作用機(jī)制的主流解釋。隨著科學(xué)的發(fā)展和研究水平的提高，人們對于氫氧化鋁的作用機(jī)制不斷有了新的認(rèn)識。

2004 年Rimanilo等研究發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁佐劑可激活固有免疫應(yīng)答。2007年Li等研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞主要對抗原進(jìn)行吞噬和破碎作用，鋁則激活細(xì)胞內(nèi)源性免疫應(yīng)答相關(guān)的Nalp3炎性復(fù)合體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生高水平的促炎癥因子IL-1β 和IL-18。Eisenbart等進(jìn)一步研究證實(shí)氫氧化鋁佐劑還可激活T2細(xì)胞分泌IL-4，誘導(dǎo)MHC-Ⅱ類分子和CD83、CD86等的表達(dá)，誘導(dǎo)Th2型體液免疫應(yīng)答。2013年周洋證實(shí)鋁佐劑可升高血漿中促炎細(xì)胞因子和趨化因子水平。

Skeda等報(bào)道Alum的佐劑性是由吸附介導(dǎo)的，因此，Alum的佐劑性取決于鋁鹽對抗原的吸附程度。Alum對蛋白抗原的吸附還與靜電吸附和疏水性的相互作用有關(guān)。帶有陰電荷的重組瘧疾疫苗，與帶有陽電荷的Alum能很好結(jié)合，而與帶陰電荷的磷酸鋁則很難結(jié)合。另外，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目也是影響吸附的重要因素，在大分子中結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目與分子量成正比。

雖然鋁佐劑是被FDA批準(zhǔn)可用于人類疫苗的佐劑，其安全性和有效性得到了人們的公認(rèn)，但鋁佐劑也有許多不足之處，如因其不能凍干，所以有些新型疫苗無法適用；當(dāng)鋁佐劑通過皮下或皮膚內(nèi)注射而不是肌肉內(nèi)注射的路徑時(shí)通可產(chǎn)生肉芽腫；而且在許多情況下鋁鹽并不是一個(gè)好的佐劑，尤其是在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答上，其可誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，但不能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時(shí)可誘導(dǎo)產(chǎn)生IgE 抗體產(chǎn)生，發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，增加發(fā)生超敏反應(yīng)的危險(xiǎn)。

1.2 油佐劑

此類佐劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中大量使用，一般包括水包油（O/W）或者油包水乳劑（W/O）和水包油包水雙相乳劑（W/O/W）。如是弗氏佐劑（FA），又可分為弗氏不完全佐劑（FIA）和弗氏完全佐劑（FCA），MF59，AS03，AF03和SE等。

弗氏佐劑（FA）是用礦物油（石蠟油）、乳化劑（羊毛脂）和滅活的分枝桿菌（結(jié)核分枝桿菌或卡介苗）組成的油包水乳化佐劑。這三種成分俱全的佐劑稱為福氏完全佐劑（Freund’s Complete Adjuvant,FCA），不含分枝桿菌的佐劑為福氏不完全佐劑（Freund’s Incomplete Adjuvant,FIA）。FIA是典型的只誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子，誘生抗體的佐劑。FCA因其中含有滅活的分枝桿菌（長介菌）成份，是標(biāo)準(zhǔn)的誘生體液和細(xì)胞免疫佐劑，可誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)IgG的產(chǎn)生，抑制IgM的產(chǎn)生，從而抑制免疫耐受的產(chǎn)生，推遲超敏反應(yīng)，增加移植排斥，促進(jìn)抗腫瘤作用。石蠟油因不能代謝而存留在注射的部位，這就阻礙了抗原降解或快速反應(yīng)，起到抗原儲(chǔ)存作用，使抗原緩慢持續(xù)的釋放，不斷刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

但因?yàn)榈V物油不能被代謝，所以會(huì)產(chǎn)生一系列的副作用，礦物油乳劑常見的副作用有注射部位的炎癥反應(yīng)、肉芽腫、潰瘍等，另外礦物油以及其中的組分如姥鮫烷、正十六烷等還會(huì)引起佐劑型關(guān)節(jié)炎等自身免疫反應(yīng)。對于人類常規(guī)的預(yù)防性疫苗來說乳劑的毒性太大，一般只是用于科學(xué)研究或癌癥患者。

隨著乳化技術(shù)的進(jìn)步，可選擇代謝油取代初期的礦物油來制備更為安全、穩(wěn)定、有效的免疫佐劑，如MF59、AS03、AF03和SE等，MF59是目前研究較熱門的佐劑之一。MF59由角鯊烯（角鯊烯是一種較石蠟油更易代謝的植物油）、Tween-80和Span-85等組成，既可以刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫也可以產(chǎn)生細(xì)胞免疫。MF59是除鋁佐劑外首個(gè)用于人類的新型佐劑，它能增強(qiáng)老年人群中流感的免疫原性，于1997年在歐洲獲得認(rèn)證作為流感疫苗的佐劑。AS03與MF59類似，在歐洲認(rèn)證用于流感疫苗，并在2009年H1N1流感大流行中得到廣泛使用。

2.新型佐劑

2.1 細(xì)胞因子類佐劑

細(xì)胞因子多屬小分子多肽或糖蛋白，相對分子質(zhì)量在15 000～35 000之間，由活化的免疫細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的，能影響其他細(xì)胞功能，對免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)有介導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用，是一類通過與高親和力的特異性受體相互作用，可在低濃度下發(fā)揮作用的生物活性物質(zhì)。目前已有多種細(xì)胞因子如IL-12、IL-15、IL-18、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和干擾素γ（IFN-γ）等作為病毒D N A 疫苗佐劑在實(shí)踐中得到應(yīng)用，并有效增強(qiáng)了D N A疫苗的特異性免疫反應(yīng)。這類物質(zhì)可與抗原共表達(dá)而發(fā)揮佐劑作用，提高核酸疫苗的免疫保護(hù)率，或組裝成表達(dá)質(zhì)粒，與抗原混合使用。

通過多年的研究，人們逐步對各種不同的細(xì)胞因子佐劑刺激機(jī)體產(chǎn)生的不同作用有了一個(gè)大致了解，細(xì)胞因子通過免疫調(diào)節(jié)提高抗原提呈能力，誘導(dǎo)并增強(qiáng)C T L 的作用；細(xì)胞因子佐劑能使機(jī)體持續(xù)產(chǎn)生抗體，并阻礙淋巴濾泡中生發(fā)中心的形成；細(xì)胞因子能將B 細(xì)胞與外周隔絕，使抗體生成下降，從而起到陰性免疫調(diào)節(jié)作用。

過去人們普遍認(rèn)為IL-12是佐劑效果最好的細(xì)胞因子，研究發(fā)現(xiàn)IL-12抑制腫瘤細(xì)胞作用很強(qiáng)，并顯著增強(qiáng)了CTL活性，同時(shí)增加內(nèi)源性IFN-γ 的分泌。最近IL-7和IL-15作為關(guān)鍵細(xì)胞因子被應(yīng)用來增強(qiáng)CD8T細(xì)胞的免疫記憶。在DNA疫苗同編碼IL-15的基因聯(lián)合投遞增強(qiáng)免疫應(yīng)答來對抗小鼠布氏桿菌感染的實(shí)驗(yàn)中，小鼠接種此疫苗增強(qiáng)了體液免疫，布氏桿菌病特異性抗體IgG 2α 的量超過了IgG1，脾臟細(xì)胞內(nèi)IL-15佐劑DNA疫苗誘導(dǎo)更高水平的IFN和CD8T細(xì)胞，同時(shí)對誘導(dǎo)CD4T細(xì)胞也有貢獻(xiàn)。

細(xì)胞因子在DNA疫苗應(yīng)用中有特殊的潛力，細(xì)胞因子可以和抗原在同一載體里共表達(dá)。但因其分泌有可能增加誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生，引起過敏反應(yīng)，增加疫苗的不良反應(yīng)。

2.2 CpG ODN佐劑

CpG是指由胞嘧啶、鳥嘌呤及使兩者相連的磷酸酯鍵組成的二核苷酸，CpG二核苷酸及其5，端和3，端的各兩個(gè)堿基構(gòu)成CpG基序。人們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，這種抗腫瘤作用是基于細(xì)菌DNA的強(qiáng)大免疫刺激功能，而這與其所含的非甲基化的CpG基序有關(guān)，因此CpG基序也被稱為免疫刺激序列，它是細(xì)菌DNA產(chǎn)生免疫刺激作用的核心結(jié)構(gòu)。

目前以CpG ODN為佐劑的細(xì)菌類疫苗的研究涉及：炭疽桿菌疫苗、傷寒疫苗、白百破疫苗、流感嗜血桿菌疫苗、霍亂疫苗等。以CpG ODN為佐劑的病毒類疫苗的研究涉及：流感病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、單純皰疹病毒疫苗、生殖器皰疹病毒疫苗等。以CpG ODN為佐劑的寄生蟲類疫苗的研究涉及：曼森血吸蟲病疫苗、瘧疾疫苗、利什曼病疫苗、鼠弓形蟲疫苗等。

雖然CpG ODN具有安全有效等優(yōu)點(diǎn)，但還是有許多問題有待于解決：比如它的免疫激活機(jī)制、免疫劑量（高劑量CpG ODN及重復(fù)給藥可能導(dǎo)致毒性效應(yīng)）和最適免疫途徑還需要進(jìn)一步研究。目前CPG作為人用乙肝疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

2.3 脂質(zhì)體佐劑

脂質(zhì)體是由磷脂和固醇類組成的雙層脂質(zhì)分子小球，能夠包裹抗原，其表面為疏水結(jié)構(gòu)，內(nèi)部為親水結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體既可做抗原載體又可做佐劑，用它包裹D N A 疫苗到達(dá)靶細(xì)胞后,脂質(zhì)體與靶細(xì)胞融合并將DNA釋放入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。巨噬細(xì)胞等吞噬了含有抗原的脂質(zhì)體，經(jīng)溶酶體酶消化釋放抗原，可激活T 細(xì)胞及B 細(xì)胞。脂質(zhì)體的佐劑效力依賴于脂質(zhì)雙分子層的數(shù)量、電荷、組成成份以及制備的方法。

脂質(zhì)體能顯著增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答，包括產(chǎn)生保護(hù)性抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，還可以作為載體與其它佐劑（如脂質(zhì)A、胞壁酰二肽及其衍生物、IL-1、IL-2等）或DNA疫苗聯(lián)合使用，刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IF-γ、IL-6和IL-12,誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T 細(xì)胞為主的免疫應(yīng)答，同時(shí)增強(qiáng)APC的遞呈能力，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答。

但作為疫苗佐劑脂質(zhì)體也存在一些不足：穩(wěn)定性較差，磷脂中的不飽和脂肪酸儲(chǔ)存時(shí)會(huì)逐漸氧化，小脂質(zhì)體傾向于相互融合成大脂質(zhì)體，在融合過程中可以導(dǎo)致包入抗原的釋放。此外，佐劑與不同的抗原合用，其非特異性免疫調(diào)節(jié)作用是不可預(yù)知的，此外免疫途徑，抗原用量對特定脂質(zhì)體疫苗免疫原性也有極大影響，所以單純脂質(zhì)體作為佐劑的作用機(jī)理不可能得到全面的詮釋。同時(shí)脂質(zhì)體在制備過程中要求一定的技術(shù)性，其費(fèi)用也比其他免疫佐劑高，目前對脂質(zhì)體的應(yīng)用研究還主要集中在醫(yī)學(xué)研究方面，在獸醫(yī)疫苗研究中的應(yīng)用前景還具有一定的不確定因素。

2.4 免疫刺激復(fù)合物（immunostinulating complex ISCOM）

ISCOM由皂角苷、膽固醇、磷脂以及抗原的磷酸鹽溶液組成。粒徑小于40nm，通過前3個(gè)組份之間的疏水作用而結(jié)合在一起，疏水的或親水的抗原均可以結(jié)合到其復(fù)合物上。主要通過增強(qiáng)APC的內(nèi)吞作用，誘導(dǎo)黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生持久的抗體滴度和保護(hù)性應(yīng)答，可通過腸道外和黏膜途徑免疫。它適用于誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的疫苗，正在臨床研究中的有流感病毒疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗。

因ISCOM產(chǎn)生有效免疫所需的抗原很少，使其有可能成為多價(jià)亞單位疫苗的有效佐劑。ISCOM具有佐劑和抗原提呈的雙重功能，既可激發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，又可刺激體液免疫。臨床研究表明，ISCOM是目前誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞系（CTL）反應(yīng)最強(qiáng)的免疫刺激物。

3.結(jié)語

合理選擇和使用佐劑不但可以節(jié)約抗原的使用量，還可以迅速刺激免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。對佐劑的研究一直是疫苗研究過程中的重要環(huán)節(jié)，理想的佐劑應(yīng)該是廣譜、無副作用、對免疫系統(tǒng)具備有效的激活作用，同時(shí)便于生產(chǎn)和使用。但是在佐劑大量出現(xiàn)的同時(shí)，隨之而來的是對其安全性的擔(dān)憂。因此，未來的工作重點(diǎn)之一應(yīng)是深入研究佐劑的作用機(jī)制，全面推測其對免疫系統(tǒng)的影響，尋找并建立合理可靠的動(dòng)物模型，預(yù)測免疫毒性發(fā)生的可能性。